Entwicklung neuer rezeptorgesteuerter Radiopharmazeutika für die Diagnostik und die Therapie von Prostata- und Mammakarzinom

Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei Projekte auf Basis von Bombesin-Agonisten und ein Projekt auf Basis des Peptids Substanz P bearbeitet. Alle Peptidderivate wurden mittels eines semiautomatischen Peptidsynthesizers und der Fmoc-Schutzgruppenstrategie an der Festphase synthetisiert.
1. Im ersten Projekt wurde eine Serie von Bombesin-Derivaten mit unterschiedlich langen Polyethylenglycol-Spacer-Einheiten (dPEG) zwischen dem Peptid und dem DOTA-Chelator synthetisiert und mit 177Lu markiert. Der Einfluss der Spacerlänge auf die biologischen Parameter der Verbindungen nat/177Lu-DOTA-dPEGx-BN(7-14) (x = 0, 2, 4, 6, 12, 24) wurde mittels in vitro- und in vivo-Experimente evaluiert.
Die Bindungsaffinitätsstudien mit GRP-Rezeptor exprimierenden Membranen zeigten für Bombesinderivate ohne Spacer bzw. mit langem Spacer hohe IC50-Werte. Es lässt sich daraus schliessen, dass Bombesinderivate einen Spacer benötigen. Ist der Spacer jedoch zu lang, wird durch die sterisch anspruchsvolle Ethylenglykoleinheit die Bindungsaffinität des Liganden zum Rezeptor herabgesetzt, wie es im Falle des natLu-DOTA-dPEG24-BN(7-14) zu sehen ist.
Am Beispiel des DOTA-dPEG4-[β-Ala11]-BN(7-14) wurde beobachtet, dass während einer 177Lu-Markierung das oxidierte 177Lu-DOTA-dPEG4-[β-Ala11,Met(O)14]-BN(7-14) als Neben-produkt entsteht. Die Verhinderung dieser Radiolyse ist sehr wichtig, da ansonsten das Bombesinderivat seine Bindungsaffinität zum GRP-Rezeptor (IC50-Wert > 1000) vollständig verliert. Durch einen 1000-fachen Überschuss eines Antioxidationsmittels wie Methionin zur Markierlösung kann dies erreicht werden.
Die Stabilitätsexperimente im humanen Blutserum zeigten, dass die 177Lu-DOTA-dPEGx-BN(7-14)-Derivate mit der Zunahme der Spacerlänge an Stabilität gewinnen. Es wurden zwei Hypothesen für diese Ursache aufgestellt: Erstens kann davon ausgegangen werden, dass die Spacerlänge einen Einfluss auf die Spaltungsstelle der Peptidsequenz hat, da möglicherweise unterschiedliche Peptidasen involviert sind. Zweitens besteht die Möglichkeit, dass die Analoga abweichende Konformationen haben, was der Grund für die biologisch unterschiedlichen Halbwertszeiten sein könnte.
Sowohl bei kurzem als auch bei langem Spacer wurden die gleichen enzymatischen Spaltungsstellen gefunden. Die Abbaukinetik hat ergeben, dass der vollständige Abbau zwar beim 177Lu-DOTA-dPEG2-BN(7-14)-Derivat einen leicht anderen Weg als beim 177Lu-DOTA-dPEG12-BN(7-14)-Derivat einschlägt, jedoch die erste und massgebende Metabolisierung vermutlich durch das gleiche Enzym erfolgt. Das Enzym wurde als Angiotensin Converting Enzym identifiziert und lässt sich durch die Substanz Captopril inhibieren.
Durch Circulardichroismus-Messungen der natLu-DOTA-dPEGx-BN(7-14) (x = 0, 2, 4, 6, 12, 24)-Analoga wurde die zweite Hypothese untersucht. Das Derivat ohne Spacer bzw. die Analoga mit einem kurzen Spacer zeigten einen hohen random coil-Charakter und die Analoga mit einem langen Spacer zeigten hohe β-sheet-Strukturen. Dieses Ergebnis deutet an, dass Peptide mit höherem β-sheet-Charakter somit eine höhere Resistenz gegenüber Peptidasen im humanen Blut aufweisen. Dies könnte eine Bestätigung für die zweite Hypothese sein, wobei die Länge des Spacers die Konformation der Analoga beeinflusst und damit auch die Serumstabilität.
Durch das Einführen eines hydrophilen Spacers wurde versucht, die Hydrophilie des Radiopharmakons zu erhöhen und damit die Aufenthaltsdauer im Blutkreislauf zu verlängeren, was einer höheren Anreicherung des Radiopharmakon am Zielort führen sollte. Der in vivo-Versuch bestätigte jedoch nicht den angenommenen Effekt. Die Bioverteilungsstudien zeigten bereits nach 4 h sehr niedrige Blutwerte, was auf eine rasche Ausscheidung der Radiopeptide hindeutet.
Die Länge des dPEG-Spacers hat vor allem einen deutlichen Einfluss auf die enzymatische Stabilität und ebenso auf die Bioverteilung. Im Allgemeinen zeigt von allen Analoga 177Lu-DOTA-dPEG12-BN(7-14) die besten pharmakologischen Eigenschaften. Der hohe Tumoruptake, sowie ein hohes Tumor-zu-Nieren- und Tumor-zu-Leber-Verhältnis bieten die besten Voraussetzungen für den Einsatz in der Klinik.
2. Da das metastabile 99mTc sehr gute radiochemische und kernphysikalische Eigenschaften besitzt und durch die Verfügbarkeit als Generatornuklid dem 111In überlegen ist, wurde ein neues Bombesin-Derivat entwickelt, das für eine 99mTc-Markierung geeignet ist.
Im zweiten Projekt wurde somit Cyclam-ahx-BN(7-14) ausgehend vom neuartigen zyklischen N4-Chelator C-Carbonsäure-Cyclam und dem an der Festphase gekoppelten Peptid ahx-BN(7-14) hergestellt. Die 99mTc-Markierung des neuen Liganden wurde anhand der konventionellen Markierungsprozedur für azyklische Chelatoren nach Nock et al. optimiert. Die Markierungszeit konnte durch Temperaturerhöhung von RT auf 95°C und dem Verzicht auf Transferliganden von 45 min auf 15 min verkürzt werden. Nach dieser neuen Markierungsvorschrift wurde in der Regel bei einer spezifischen Aktivität von 12.8 MBq/nmol eine Markierausbeute > 97% erreicht.
Das neu entwickelte Derivat 99mTc-Cyclam-ahx-BN(7-14) wurde mit dem von Hofmann et al. publizierten 111In-DOTA-ahx-BN(7-14) in vitro verglichen.
Bezogen auf die Bindungsaffinität zum GRP-R zeigt der nichtkomplexierte Ligand Cyclam-ahx-BN(7-14) einen 15fach niedrigeren IC50-Wert als DOTA-ahx-BN(7-14). Ebenso wurde für die 99mTc-markierte Substanz eine höhere biologische Halbwertszeit im humanen Blutserum bestimmt als für 111In-DOTA-ahx-BN(7-14). Die Internalisierung von 99mTc-Cyclam-ahx-BN(7-14) war jedoch mit 19.8% deutlich schlechter als jener der Vergleichsverbindung mit 32%.
3. Der Bombesinagonist DOTA-Gly-AMBA-BN(7-14) (DOTA-AMBA) wurde von Lantry et al. entwickelt und in vitro und in vivo charakterisiert. 177Lu-DOTA-AMBA zeigt für die Klinik vielversprechende Resultate, daher war das Ziel des dritten Projekts DOTA-AMBA nachzusynthetisieren, mit 67Ga bzw. 177Lu zu markieren und die Resultate der durchgeführten pharmakologischen Experimente miteinander zu vergleichen. Bei positiven Ergebnissen bietet DOTA-AMBA eine vielversprechende diagnostische Option durch Markierung mit dem Positronenemitter 68Ga.
Der Agonist 67Ga-DOTA-AMBA zeigte in vitro als auch in vivo ähnlich gute, teilweise sogar bessere Ergebnisse als 177Lu-DOTA-AMBA. Die Bindungsaffinität zu GRP-R, die biologische HWZ im humanen Blutserum und die Internalsierungsrate waren nahezu identisch. Der Tumoruptake war mit 5.6% ID/g etwas besser im Vergleich zu 177Lu-DOTA-AMBA (4.5% ID/g). Der Pankreas- und ebenso der Nebennierenuptake waren jedoch mit 68.8% ID/g respektive mit 18.1% ID/g fast doppelt so hoch gegenüber 177Lu-DOTA-AMBA.
Wird jedoch ein Vergleich zwischen 177Lu-DOTA-AMBA und 177Lu-DOTA-dPEG12-BN(7-14) gezogen, zeigt DOTA-AMBA zwar eine höhere Bindungsaffinität zum GRP-R und bessere Internalisierungs- (Faktor 1.5) wie auch Externalisierungsraten (Faktor 1.2), jedoch besitzt das dPEG12-Analogon eine bessere enzymatische Stabilität (Faktor 1.6) und ebenfalls günstigere Bioverteilungsdaten. Für die Therapie wäre 177Lu-DOTA-dPEG12-BN(7-14) vermutlich besser geeignet als 177Lu-DOTA-AMBA.
4. Im vierten Projekt wurde die Oximreaktion zwischen para-211At-Benzaldehyd und einem aminooxyfunktionalisierten Substanz P-Derivat simuliert. Dazu wurde die Reaktion zwischen para-Fluorbenzaldehyd und dem Substanz P-Derivat unter ähnlichen Stoffmengenverhältnissen einer radioaktiven Markierung (sehr hohe Verdünnung) untersucht. Da das Peptid die Aminosäure Lysin enthält, welche ebenfalls mit dem Aldehyd zu einem Imin reagieren könnte, wurde anhand von zwei kurzen Modellverbindungen die Chemoselektivität der Aminooxyfunktion überprüft. Es wurde ein Tripeptid mit Lysin und ein Tripeptid mit der Aminooxyfunktion synthetisiert. Die Reaktivität der verschiedenen funktionellen Gruppen wurde mit dem Reagenz para-Fluorbenzaldehyd anschliessend untersucht. In saurem Milieu bei pH 3 wurde keine Reaktion zwischen der ε-Aminogruppe des Lysins und dem Aldehyd festgestellt. Eine schnelle Reaktion wurde jedoch zwischen dem Tripeptid mit der Aminooxygruppe und dem Reagenz beobachtet. Die hohe Chemoselektivität der Aminooxy- gegenüber der Aminofunktion ist somit gewährleistet.
Optimale Bedingungen für die Oximreaktion zwischen aminooxyacetyl-[Thi8,Met(O2)11]-Substanz P und para-Fluorbenzaldehyd herrschen in Acetat- oder Zitratpuffer pH 3 und bei einer Reaktionstemperatur von 60°C. Nach 60 min wurde eine Ausbeute von > 90% erreicht, wobei das Produkt Fluorobenzylidenoxim-acetyl-[Thi8,Met(O2)11]-Substanz P in der Reaktionslösung bei RT über 24 h stabil blieb. Diese simple Reaktion ist wegen ihrer Chemoselektivität und der kinetisch schnell ablaufenden Reaktion für die Herstellung eines 211At-markierten Substanz P-Derivats sehr geeignet.