"Mycobacterium ulcerans" disease and treatment : a histopathological perspective

Summary: Buruli ulcer (BU) caused by Mycobacterium ulcerans is a chronic necrotizing skin disease with the highest prevalence in West-African countries. The current WHO treatment recommendation is a combination of the two antibiotics rifampicin, given orally and streptomycin, requiring daily injections. Although antibiotic treatment reduced recurrence rates below 2% and circumvents surgical excision in part of the patients, toxic side effects, immunopathological adverse events and other wound healing disorders may occur. In this thesis we conducted detailed histopathological studies to better characterize responses to antibiotic treatment and the nature of paradoxical reactions.
In the case of non-ulcerative plaque lesions, we observed in half of all patients either an enlargement or ulceration of lesions during antibiotic therapy. Histopathological analysis after completion of antibiotic treatment revealed the persistence of extensive necrotic areas besides hallmarks of successfully treated BU lesions, like infiltration, granuloma formation and loss of solid staining of the mycobacteria. Where removal of the necrotic tissue by the immune system is not efficient enough, lesions are ulcerating, leading to the discharge of necrotic tissue. Based on the clinical and histopathological data it is suggested to support healing of such plaque lesions by surgical débridement. While our data demonstrate that the antibiotic therapy efficiently destroys M. ulcerans infection foci, they also indicate that proper wound management during and after chemotherapy is for advanced BU lesions as important as the antibiotic treatment itself.
Secondary lesions may occur at distant body sites during and after chemotherapy. Our analysis of such secondary lesions revealed hallmarks of inactive M. ulcerans infection. Emergence of secondary lesions during antibiotic treatment may thus be the result of immune-mediated paradoxical reactions driven by mycobacterial antigens and immunostimulators at sites of clinically inconspicuous infection foci. These lesions may, however, also have arisen from new infections or mycobacteria that have survived chemotherapy. In this case our histopathological findings would indicate that after priming during the successful treatment of the initial lesion, the immune system is capable of eliminating new infection foci. Our results demonstrate that no additional antibiotic treatment is necessary, when such secondary lesions appear.
To reduce the danger of toxic side effects and to obviate the need for daily injections, an entirely oral treatment without streptomycin would be preferable. In the framework of this thesis we analyzed tissue samples from a first clinical treatment trial using clarithromycin instead of streptomycin. Histopathological findings and efficacy were comparable to the current treatment, leading to the planning of a WHO-sponsored large multi-center trial comparing the efficacy of eight weeks treatment with clarithromycin and rifampicin versus streptomycin and rifampicin.
To gain deeper insights into the histopathological changes in the very early phase of M. ulcerans infection, we conducted in parallel to the analysis of clinical samples, longitudinal histopathological studies in experimentally infected mice. Many features found in the mouse model, such as an early wave of infiltrating neutrophils, as well as the formation of B-cell clusters and the loss of solid Ziehl-Neelsen staining of mycobacteria during chemotherapy, have correlates in human BU lesions. The mouse infection model thus appears to be suitable for the preclinical evaluation of new drug treatments and of candidate vaccines.
Taken together the results described in this thesis demonstrate that histopathology is an important tool to strengthen diagnosis of BU, to evaluate new treatment regimens and to come to a better understanding of paradoxical reactions emerging during antibiotic treatment of BU.
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Zusammenfassung: Das Buruli-Ulkus (BU) ist eine nekrotisierende Hauterkrankung, die von Mycobacterium ulcerans hervorgerufen wird und vor allem in den tropischen Regionen West-Afrikas auftritt. Gegenwärtig empfiehlt die Weltgesundheits-organisation (WHO) eine systemische Chemotherapie mit dem oral verabreichten Antibiotikum Rifampicin kombiniert mit einer täglichen Injektion von Streptomycin. Nach dieser Therapie treten bei weniger als 2% der Patienten Rückfälle auf und eine chirurgische Zusatzbehandlung der Läsion ist bei vielen Patienten nicht erforderlich. Allerdings können toxische Nebenwirkungen sowie immunpathologische Reaktionen und andere Wundheilungsstörungen auftreten. In der vorliegenden Arbeit wurden detaillierte histopathologische Studien durchgeführt, um die therapeutische Wirksamkeit der Chemotherapie des BU besser zu verstehen und die Natur von paradoxen Reaktionen zu charakterisieren.
Bei vielen Patienten mit zunächst geschlossenen BU Plaques kommt es während der Chemotherapie zur Ulzeration. Unsere histopathologischen Analysen zeigten, dass auch nach Beendigung der vollständigen Antibiotika-Behandlung noch grosse nekrotische Gewebebereiche zurückbleiben können. Daneben sind andererseits auch typische Merkmale einer behandelten BU-Läsion wie Infiltration, Granulom-Bildung und Verlust der vollständigen Anfärbbarkeit der Mycobakterien zu beobachten. Unvollständige Resorption des nekrotischen Gewebes durch das Immunsystem führt jedoch häufig zur Ulzeration und Abstossung des nekrotischen Gewebes. Basierend auf unseren histopathologischen und klinischen Daten erscheint es angezeigt, die vollständige Ausheilung von Plaques durch chirurgisches Debridement zu beschleunigen. Die Befunde zeigen, dass M. ulcerans Bakterien durch die Chemotherapie mit Rifampicin und Streptomycin zwar effektiv abgetötet werden, dass aber vor allem im fortgeschrittenen Stadium eine gute Wundversorgung für den Heilungserfolg beim BU ebenso wichtig ist.
Bei einem Teil der BU Patienten entwickeln sich während oder nach Abschluss der Chemotherapie sekundäre Läsionen. Bei der Analyse solcher Läsionen haben wir charakteristische Merkmale einer inaktiven M. ulcerans Infektion gefunden. Der Auslöser für die Entwicklung von Sekundärläsionen könnte daher eine paradoxe Immunreaktion gegen noch im Gewebe vorhandene mykobakterielle Antigene bei klinisch zuvor nicht auffälligen Infektionsherden sein. Möglich wäre allerdings auch, dass sich nach der Chemotherapie durch überlebende Mycobakterien oder durch Neuinfektion neue Läsionen gebildet haben. In diesem Fall würden unsere Ergebnisse darauf hindeuten, dass die neuen Infektionsherde durch eine während der Erstinfektion gebildete protektive Immunantwort zerstört worden sind. Insgesamt zeigen unsere Untersuchungen, dass eine erneute Antibiotikagabe beim Auftreten von sekundären Läsionen nicht erforderlich ist.
Zur Reduzierung der Gefahr toxischer Nebenwirkungen und zur Vermeidung der täglich erforderlichen Injektionen, wäre eine vollständig orale Chemotherapie ohne Streptomycin anstrebenswert. Bei einer ersten klinischen Studie, bei der Streptomycin durch Clarithromycin ersetzt wurde, waren Wirksamkeit und histopathologische Beobachtungen vergleichbar zu den Ergebnissen mit der gegenwärtigen Standardtherapie. Basierend auf diesen Ergebnissen plant die Weltgesundheitsorganisation eine multizentrische klinische Studie, bei der 8 Wochen Rifampicin/Clarithromycin mit 8 Wochen Rifampicin/Streptomycin verglichen werden soll.
Um einen tieferen Einblick in die frühen Phasen der M. ulcerans Infektion zu bekommen, wurden longitudinale histopathologische Untersuchungen mit experimentell infizierten Mäusen durchgeführt. Viele histopathologische Befunde, wie das Auftreten einer ersten Infiltration mit Neutrophilen in der Frühphase der Infektion und die Entwicklung von B-Zell-Anhäufungen und der Verlust der gleichmässigen Anfärbbarkeit der Mycobakterien während der Chemotherapie haben Entsprechungen bei der BU Erkrankung beim Menschen. Das Mausmodell scheint daher geeignet zu sein, neue Therapien und Kandidaten-Impfstoffe präklinisch zu testen.
Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass die Histopathologie nicht nur ein sehr aussagekräftiges Diagnosewerkzeug ist, sondern dass sie auch einen wichtigen Beitrag zur Beurteilung neuer Behandlungsmethoden und zur Erforschung paradoxer Reaktion während der Antibiotika Behandlung leisten kann.