Regulation of gene expression by micrornas : targeting specificity, kinetics and function

Summary: Understanding gene regulation is a central question of molecular biology. For decades, gene expression was thought to be controlled by a complex network of proteins called transcription factors. But ten years ago, microRNAs (miRNAs), a distinct class of short, evolutionarily-conserved non-coding RNAs were found to regulate gene expression. Hundreds of miRNAs have since then been discovered in species ranging from plants to nematodes to mammals, where they regulate diverse biological processes such as development, metabolism, immunity, cell cycle. MicroRNAs load into the Argonaute protein of the RNA-Induced Silencing Complex (RISC) and provide binding specificity to it. Upon guiding the RISC to a complementary motif in the 3' untranslated transcribed region (UTR) of a mRNA, miRNAs inhibit the translation and increase the decay rate of the target mRNA.
While the molecular machinery required for miRNA action is well characterized, the biological function of the miRNAs identified so far remains unknown. Neither do we know through what target genes miRNAs achieve their biological function. The most common approach to this question consists in identifying genes that are differentially expressed following the experimental perturbation of the expression of a given miRNA by means of genetic knock-out or transfection. Perturbing the expression of a single miRNA has important side-effects on gene expression, but this problem can be partly addressed by crossing the genes responding to the miRNA perturbation with computational miRNA target predictions. In this thesis, we first illustrate how such a combined experimental and computational approach can be used to understand how the miR-375 miRNA controls glucose homeostasis.
However, in practice, extracting direct, functional miRNA targets from miRNA perturbation experiments and computational predictions is a difficult task because state-of-the-art computational predictions yield large amounts of false-positives. We therefore set to improve the accuracy of computational predictions by inferring what sequence and structure properties characterize functional miRNA binding sites in a large number of miRNA perturbation experiments. We then combined these properties into an algorithm that is most accurate at miRNA target prediction. Also, we show that miRNA binding sites carried by mRNAs that respond to miRNA perturbation share the same properties as miRNA binding sites that are under evolutionary selective pressure, suggesting that miRNA binding sites may have been shaped by evolution to favor mRNA degradation. Further analyses also lead to the view that the temporal aspects of miRNA regulation may be far more important to the miRNA target identification problem than previously thought, especially for experiments measuring the effects of miRNA perturbation at the protein level, where taking the temporal aspects of miRNA regulation into account appears necessary both during experimental design and subsequent data analysis.
While measurements from combined miRNA perturbation experiments and omics assays are crucial to determining what genes are regulated by a given miRNA, they are contaminated by side-effects and do not provide information on the precise location of the miRNA binding site within the 3' UTR of the target genes. To address these problems, we introduce PAR-CLIP, a combination of biochemical and computational methods to identify miRNA binding sites in high-throughput. The mRNA-miRNA-Argonaute ternary complex are first cross-linked. The ternary complex is then immuno-precipitated and the unprotected RNA eliminated by enzymatic digestion. Finally, ultra high-throughput sequencing of the remaining RNA and computational processing of the resulting sequencing libraries reveals the precise mRNA regions bound by miRNAs. PAR-CLIP does not require miRNA perturbation and makes it possible to identify thousands of miRNA binding sites in one experiment, with nucleotide resolution.
In summary, the present thesis establishes methods that make it possible to map miRNA-mRNA interactions with high accuracy in the spatial domain, and paves the way for future investigation of miRNA-mediated gene regulation in the temporal domain. These methods will be useful in understanding the miRNA-mRNA interactions underlying the implication of miRNAs in the regulation of biological processes.
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Zusammenfassung: Die Regulation der Genexpression ist eine zentrale Frage der molekularen Biologie. Während Jahrzehnten wurde angenommen, dass die Expression der Genen von komplexen Netzwerken kontrolliert wird, die aus Proteinen, so genannten Transkriptionsfaktoren bestehen. Vor zehn Jahren wurde entdeckt, dass microRNAs (miRNAs) eine eigene Klasse kleiner, in der Evolution konservierter, nicht-codierender RNA bilden, die Genexpression regulieren. Seitdem wurden hunderte von miRNAs in Organismen, unter ihnen Pflanzen, Nematoden und Säugetieren entdeckt, wo sie diverse biologische Prozesse wie Entwicklung, Metabolismus, Immunität, Zellzyklus regulieren. MicroRNAs binden an die Argonaute Protein vom RNA-Induced Silencing Complex (RISC) und bestimmen so die Bindungsspezifität der Argonaute. MiRNAs führen dann den RISC zu einem komplementären Motif der 3' untranslatierten Region (UTR) einer mRNA, was zur Inhibition der Translation und zur Erhöhung der Zerfallsrate der gebundenen mRNA führt.
Während die molekularen Mechanismen der Genexpressionsregulation durch miRNAs identifiziert wurden, bleibt die biologische Funktion einer grossen Mehrheit der miRNAs, die so weit entdeckt wurden, unbekannt. Es ist zudem unklar, durch welche Gene die miRNA ihre Funktion ausüben. Die häufigste Herangehensweise, diese Frage zu beantworten ist die Identifikation von Genen, deren Expression durch eine gegebene miRNA gestört wird. Genetische Knock-Outs oder Transfektionen sind experimentelle Mittel um die Expression zu stören. Die Expression einer einzelnen miRNAs zu stören kann erhebliche sekundäre Effekte auf die Expression von Genen haben. Durch die Kreuzung von miRNA abhängigen, differentiel exprimierten Genen mit rechnergeschützten miRNA Bindundungsstellenvorhersagen (rmBV) kann dieses Problem teilweise gelöst werden. In dieser Dissertation wurde diese Strategie eingesetzt um zu untersuchen, wie miRNA-375 die Glukosehomeostase kontrolliert.
In der Praxis ist es jedoch eine anspruchsvolle Arbeit, direkte, funktionelle miRNA Zielgene aus miRNA-Störungsexperimenten und rmBV zu extrahieren da rmBV in der Regel einen hohen Anteil an falsch Positiven liefern. Wir verbesserten die Genauigkeit der rmBV indem wir die Sequenz- und Struktureigenschaften von funktionellen miRNA Bindungsstellen aus einer grossen Anzahl von miRNA Störungsexperimenten charakterisierten. Die identifizierten Eigenschaften wurden dann mit dem Algorithmus zur Vorhersage der miRNA-Bindungsstellen kombiniert, der bei der Identifikation von Ziel-miRNA am genauesten ist. Zudem zeigen wir, dass miRNA Bindungsstellen von miRNA-abhängigen mRNAs dieselben Eigenschaften aufweisen wie Bindungsstellen, welche unter evolutionärem Selektionsdruck stehen. Das führt zur Hypothese, dass miRNA Bindungsstellen durch die Evolution umgeformt wurden, um den mRNA Zerfall zu bevorzugen. Weitere Analysen führten zur Auffassung, dass die zeitlichen Aspekte der miRNA Regulation viel wichtiger sein könnten als bisher angenommen. Dies speziell für Experimente, die den Effekt der miRNA Störung auf der Ebene der Proteine messen. Bei diesen Experimenten scheint es unentbehrlich zu sein, während der Planung und Datenanalyse Rücksicht auf die zeitlichen Aspekte der miRNA Regulation zu nehmen.
Messungen aus kombinierten miRNA Störungsexperimenten und Omics-Versuchen sind ausschlaggebend um festzustellen welche Gene von einer bestimmten miRNA reguliert werden. Sie leiden jedoch darunter, dass sie von sekundären Effekten gestört werden und dass sie keine Information über die genaue Lokalisation der miRNA Bindungsstellen liefern. Um diese Probleme zu lösen wurde die PAR-CLIP Methode entwickelt. Dies ist eine Kombination aus biochemischen und rechnergestützten Methoden um miRNA Bindungsstellen in hohen Datendurchsätzen zu identifizieren. Die ternären mRNA-miRNA-Argonaute Komplexe werden erst kovalent gebunden, dann immuno-prezipitiert. Danach wird die ungeschützte RNA in einem enzymatischen Verdau eliminiert. Schlussendlich wird die verbleibende RNA sequenziert und durch rechnergestützte Verarbeitung der Sequenzierdaten wird festgestellt, welche spezifischen mRNA Regionen von miRNAs gebunden werden. PAR-CLIP benötigt keine miRNA Störung und ermöglicht die Identifizierung tausender miRNA Bindungsstellen Nukleotid-Auflösend in einem einzigen Versuch.
Zusammengefasst führt diese Dissertation Methoden ein, mit denen sich miRNA-mRNA Wechselwirkungen mit hoher räumlicher Genauigkeit kartografisieren lassen. Zudem öffnet sie den Weg für zukünftige Untersuchungen von zeitlichen Domänen in der miRNA vermittelten Genregulation. Diese Methoden werden entscheidend zum Verständnis der miRNA-mRNA Wechselwirkungen beitragen und den Einfluss der miRNA in der Regulation biologischer Prozesse betonen.