Analysis of the role or Rab4 and Rab11 in endosomal carrier formation and transferrin recycling

Abstract: In all eukaryotic cells, membrane transport is essential to distribute proteins from the endoplasmic reticulum to their respective destination, i.e. the Golgi, the endosomal/lysosomal system and the cell exterior. A multitude of proteins is involved in membrane transport, functioning as building blocks for vesicular coats, as regulators of transport, and as targeting and fusion factors. An important set of regulators are the Rab GTPases, which are known to be involved in multiple steps of membrane traffic. However, in many cases, the molecular mechanism of individual transport steps is not yet fully understood. We are interested in the molecular mechanism of two of these Rabs, Rab4 and Rab11, and their function in the late secretory/recycling system.
In order to study the late secretory/recycling system we make use of an in vitro permeabilized-cell assay and a novel recycling assay. The in vitro permeabilized-cell assay reconstitutes the specific step of carrier formation at endosomes. The function of proteins can be analyzed by modifying the cytosol used in this assay. We have adapted the assay to using cytosol from cultured cells instead of calf brain cytosol. The advantage of cultured cell cytosol is the possibility to modify the composition of the cytosol already in vivo by overexpression of wild-type and mutant proteins or by gene silencing. We have also established a novel in vivo recycling assay, which makes use of automated immunofluorescence imaging and image analysis software to analyze overall recycling. In this assay, the fluorescence intensity of a reporter cargo can be measured in distinct organelles of thousands of cells at different time points.
For this purpose stable HeLa cell lines expressing dominant negative and constitutively active mutants of Rab4 and Rab11 under an inducible promoter, as well as RNAi knockdown cell lines were created. These cells were then used in the fluorescent recycling assay, and the cytosol of these cells in the in vitro assay. Rab4 and Rab11 were both found to be involved in the formation of transport carriers at endosomes containing the transferrin receptor and the EGF receptor. However, in vivo the activity of the two Rabs was not essential for overall transferrin recycling. These results suggest that the transferrin receptor is transported in Rab4 and Rab11 dependent carriers, but it is not exclusively dependent on being transported in either of them, and can be efficiently recycled through more than one pathway. Compensatory mechanisms appear to be involved. Future work will investigate the impact on transferrin recycling, when Rab4 and Rab11 are simultaneously impaired. ---------- Zusammenfassung: Komplex Herstellung. Zwei neue Ligandenklassen wurden hergestellt und in der Iridium-katalysierten asymmetrischen Hydrierung getestet. Ausgehend von R,R- und S,S-Diphenylethylendiamin verbunden mit verschiedenen chiralen Pyridinylalkoholen wurden zwölf verschiedene Diazaphospholidin-Liganden hergestellt und zu Iridium-Komplexen umgesetzt. Diese Komplexe wurden in der Hydrierung von verschiedenen unfunktionalisierten und funktionalisierten Alkenen, besonders aber für alpha, beta-ungesättigte Carbonsäureester, getestet. Die Hydrierungen der verschiedenen Alkene waren sehr erfolgreich, sie lieferten Enantiomerenüberschüsse von bis zu 99%. Bei alpha-methylierten alpha, beta-ungesättigten Carbonsäureestern mit verschiedenen Substituenten in der beta-Position ergaben die Hydrierungen über 90% ee. Für die beta-methylierten Carbonsäureester lieferten die neuen Iridium-Komplexe bis zu 97% ee.
Die Entwicklung und Herstellung von neuen P,N-Liganden, welche auf Imidazolinen basieren, wurde als nächstes untersucht. Strukturell ähnliche Oxazolin-Liganden wurden durch Imidazoline ersetzt. Durch das zusätzliche Stickstoffatom kännen die elektronischen und sterischen Eigenschaften der Liganden modifiziert werden. Eine erfolgreiche Syntheseroute zur Herstellung der Imidazolin-Iridium-Komplexe wurde entwickelt. Allerdings waren die Hydrierungen mit den neuen Imidazolin-Iridium-Komplexen eher unbefriedigend.
Eine Verbesserung der Imidazolin-Liganden gelang, indem man den aromatischen Ring am Stickstoffatom durch eine Sulfonyl-Gruppe ersetzte. Es wurde eine neue Syntheseroute für diese Ligandenklasse entwickelt und es konnten somit vier neue Sulfonyl-Imidazolin-Iridium-Komplexe hergestellt und in der asymmetrischen Hydrierung getestet werden. Die Hydrierungen von verschiedenen unfunktionalisierten und funktionalisierten Alkenen lieferten Enantiomerenüberschüsse von über 90%.
Anwendung in Naturstoff- und Wirkstoffsynthesen. Der zweite Teil dieser Arbeit war die Anwendung der Iridium-katalysierten asymmetrischen Hydrierung zur Herstellung von biologisch wichtigen Naturstoffen. Bei einer Zusammenarbeit mit Prof. J. Mulzer (Universität Wien, …sterreich) wurde eine asymmetrische Synthese für Platensimycin entwickelt. Die geplante Syntheseroute beinhaltete die asymmetrische Hydrierungen von zwei Zwischenstufen, welche erfolgreich mit exzellenten Umsätzen und Enantioselektivitäten erreicht wurden. Dabei lieferte der Iridium-Komplex 67c die besten Ergebnisse. Die Zwischenstufe konnte mit einer geringen Katalysatorbeladung und im Gramm-Ma§stab umgesetzt werden.
Das nächste Projekt war die Synthese von Aliskiren. Dabei wurden verschiedene Ester hergestellt und in der Iridium-katalysierten asymmetrischen Hydrierung getestet. Nach einer ausgiebigen Suche für einen geeigneten Katalysator lieferte der PHOX-Komplex 28a und der PHIM-Komplex 134a für den tert-Butylester vollständigen Umsatz und 99% ee.