Molecular epidemiology and population genetics of "Plasmodium vivax" in Papua New Guinea

Abstract: In recent years a new focus has been put on malaria, and elimination and eradication of this disease has been brought back to the agenda. While Plasmodium falciparum causes most of the disease in Africa, P. vivax is predominant in malaria endemic regions in Latin America, Asia and the South Pacific. In the last 10 years increasing reports of severe disease and even mortality caused by P. vivax raised new awareness for this parasite. Forty percent of the world population lives in areas of P. vivax transmission, and severe disease is caused especially in infants and young children. P. vivax has the ability to form semi-dormant liver hypnozoites that can relapse and lead to clinical disease after an extended period of time. As most currently applied drugs are not effective against hypnozoites, they present a mayor obstacle towards malaria control.
In the lowlands of Papua New Guinea (PNG), malaria prevalence reaches levels similar to those in sub-Saharan Africa. Both P. falciparum and P. vivax are frequent, and P. vivax reaches prevalence higher than anywhere else in the world. Individuals from these regions are often co-infected by both parasite species. Multiple concurrent infections with different strains of P. falciparum or P. vivax are common. For this thesis I have genotyped over 3000 P. vivax positive blood samples collected in a cohort study of 264 children. These children, aged 1 to 4.5 years, were followed over 16 months and visited every 8 weeks for collection of two blood samples taken 24 hours apart. Additional samples were collected whenever the children presented sick to the local health centre. In parallel morbidity data was collected. P. vivax was genotyped using two size polymorphic markers, which both distinguished individual parasite clones. Genotyping data of P. falciparum clones was available from a previous study.
Extensive diversity of the genotyping markers and high multiplicity of infection (MOI, the number of co-occurring clones per carrier) was observed. Each P. vivax positive child carried a mean of 2.7 concurrent infections, mean MOI was nearly twice as high as P. falciparum multiplicity in the cohort. We did not detect a seasonal trend in MOI, and only a moderate increase of MOI with age, most pronounced in very young children up to 3 years. Most likely relapses increase P. vivax mean MOI, and they also lead to high MOI during seasons of less transmission.
The detection of parasitemia in field surveys is imperfect owing to parasite densities below or fluctuating around the detection limit of light microscopy or PCR. We have compared >1000 pairs of samples collected 24 hours apart. The collection of a second sample was found to have a limited effect on parasite prevalence: a single PCR missed only 6 to 9% of the combined parasite positivity. The proportion of individual clones missed was more pronounced. Depending on the marker, 19% or 31% of all P. vivax clones were missed when sampling on a single day. As a consequence, mean MOI increased from 2.7 to 3.4 when combining results from paired samples. Detectability does not differ between P. vivax and P. falciparum or between age groups. Thus comparisons of prevalence and MOI between species and age trends are not biased by detectability.
To investigate structuring of P. vivax population in PNG, we have typed a subset of samples with 13 additional markers. Allele frequencies and haplotypes were compared to those from samples collected at other sites in PNG. No differences were detected between parasite populations, most likely because of high gene flow between sites. This is in contrast to the situation in countries of lower endemicity, and differs from the earlier observed moderate structuring in P. falciparum populations from PNG.
In this cohort study, the incidence of P. vivax malaria decreased with age, whereas the incidence of P. falciparum peaked later at the age of 3.5 years. These contrasting trends are in line with results from other countries were both parasites are co-endemic. Differences in the parasite biology, e.g. a more limited reservoir of surface antigens of P. vivax compared to P. falciparum, might cause faster immunization against P. vivax and thus the different age trends in incidence. But also differences in transmission intensity might be responsible. Our typing of clones over an extended period of time allowed estimations of the molecular force of infection (molFOI), i.e. the number of infections per child per year. Each child acquired 14 P. vivax clones per year, but only 6 P. falciparum clones. molFOI did not change with age, suggesting that acquired immunity builds up gradually with each new clone, leading to a decrease in P. vivax incidence over time. This does not rule out that biological differences between P. vivax and P. falciparum also play a role.
PNG is among the countries with the poorest health infrastructure and the highest prevalence of malaria. P. vivax prevalence is in some regions as high as P. falciparum prevalence. High MOI and molFOI, as well as high levels of gene flow imply great resilience of P. vivax towards antimalarial interventions. Fast acquisition of semi-immunity leads to a large number of asymptomatic P. vivax carriers, potentially contributing to transmission, and control is further complicated by relapses, occurring in the blood weeks or months after transmission from the mosquito. The high proportion of P. vivax will be a major challenge towards malaria control and elimination in PNG. ---------- Zusammenfassung: In den letzten Jahren erhielt die Krankheit Malaria neue Aufmerksamkeit, und ihre Ausrottung in einzelnen Ländern oder gar weltweit wird wieder als realistisches Ziel angesehen. Plasmodium falciparum verursacht die meisten Krankheitsfälle in Afrika, dagegen ist P. vivax der vorherrschende Parasit in Malariagebieten in Lateinamerika, Asien und dem Südpazifik. In den letzten zehn Jahren haben Forschungen gezeigt, dass P. vivax häufig schwere Krankheit bis hin zum tödlichen Verlauf verursachen kann, insbesondere bei Kleinkindern. Dadurch geriet der Parasit nach Jahren mit wenig Beachtung erneut in den Fokus der Forschung. Vierzig Prozent der Weltbevölkerung leben in Gebieten mit P.vivax-Übertragung. P. vivax hat die Fähigkeit, Ruhestadien zu bilden, welche längere Zeit nach der Übertragung zum erneuten Krankheitsausbruch führen können. Die meisten der heute vorhandenen Medikamente sind wirkungslos gegen Leberstadien, darum sind diese eine grosse Hürde auf dem Weg zur Bekämpfung von Malaria.
In tief liegenden Gebieten von Papua Neuguinea erreicht die Malariaprävalenz Werte ähnlich der in Afrika südlich der Sahara. P. falciparum wie auch P. vivax sind häufig, und die P. vivax Prävalenz ist höher als irgendwo sonst auf der Welt. Bewohner dieser Gegenden sind häufig gleichzeitig mit beiden Spezies infiziert, sowie mit verschiedenen Linien derselben Art. Für diese Arbeit wurden die P. vivax Stämme in über 3'000 positiven Blutproben analysiert, die im Rahmen einer Kohortenstudie mit 264 Kindern gesammelt wurden. Diese Kinder im Alter von 1 bis 4.5 Jahren wurden während 16 Monaten alle 2 Monate besucht um im Abstand von 24 Stunden zwei Blutproben zu sammeln. Zusätzliche Proben wurden gesammelt, wann immer ein Kind eines der Gesundheitszentren aufsuchte. Parallel dazu wurden alle Erkrankungen der Kinder registriert. P. vivax Stämme wurden aufgrund von zwei molekularen Markern, bei welchen sich die Allele in der Grösse unterscheiden, typisiert. Im Rahmen einer vorhergehenden Studie wurden die P. falciparum Stämme in der Kohorte typisiert.
Die gewählten Marker wiesen eine hohe Diversität auf, und die Multiplizität (die Anzahl verschiedener Stämme pro Träger) war hoch. Jedes infizierte Kind trug im Schnitt 2.7 P. vivax Stämme, dieser Wert ist fast doppelt so hoch wie derjenige von P. falciparum. Es gab keine saisonalen Unterschiede in der Multiplizität, und nur einen geringen Anstieg der Multiplizität mit dem Alter der Kinder; dieser war am deutlichsten in sehr jungen Kindern unter 3 Jahren. Es ist davon auszugehen, dass wiederausbrechende Leberstadien die Multiplizität erhöhen, dies auch während Jahreszeiten mit geringerer Übertragung durch Mücken.
In Feldstudien ist die Detektion von Parasiten häufig unvollständig, d.h. die Dichte eines Teils der Parasiten liegt unter der Nachweisgrenze von Mikroskopie oder molekularen Methoden wie PCR. Wir haben über 1000 Blutproben-Paare verglichen, welche im Abstand von 24 Stunden gesammelt wurden. Die zusätzliche zweite Blutprobe hatte einen eher geringen Einfluss auf die Prävalenz, mittels PCR wurden nur 6 bis 9% der Proben falsch negativ diagnostiziert. Der Anteil der Stämme, die in einer einzelnen Proben nicht detektiert wurden, war dagegen ausgeprägter. Je nach Marker wurden 19 oder 31% aller P. vivax Stämme, die an mindestens einem der 2 Tage nachgewiesen wurden, am Tag 1 nicht entdeckt. Als Folge stieg die Multiplizität von 2.7 auf 3.4 wenn die Resultate von beiden Tagen kombiniert wurden. Die Wahrscheinlichkeit, einen Stamm zu detektieren, unterscheidet sich nicht zwischen P. vivax und P. falciparum oder in verschiedenen Altersklassen, folglich werden Vergleiche der Prävalenz und Multiplizität nicht beeinflusst.
Um die Populationsstruktur von P. vivax in Papua Neuguinea zu untersuchen haben wir einen Teil der Proben aus unserer Kohorte mit 13 weiteren molekularen Markern untersucht. Die Allele-Frequenzen und die Haplotypen wurden verglichen mit den-jenigen von drei anderen Orten in Papua Neuguinea. Es wurden keine Unterschiede zwischen diesen Parasitenpopulationen festgestellt, sehr wahrscheinlich aufgrund eines häufigen genetischen Austauschs zwischen den Populationen. Im klaren Gegensatz dazu wurden in Gebieten mit geringer P. vivax Prävalenz ausgeprägte Unterschiede zwischen Populationen beobachtet, und in früheren Studien wurde auch eine moderat ausgeprägte Populationsstruktur von P. falciparum in Papua Neuguinea festgestellt.
Die Inzidenz von P. vivax, also die Anzahl Erkrankungen, nahm in der Kohorte mit dem Alter deutlich ab, dagegen stieg die P. falciparum Inzidenz bis zu einem Alter von 3.5 Jahren. Diese gegensätzlichen Trends bestätigen Beobachtungen aus anderem Gebieten, wo beide Parasiten endemisch sind. Als mögliche Ursache kommen Unterschiede in der Biologie der Parasiten in Frage, z.B. eine kleinere Diversität von Oberflächenproteinen von P. vivax, wodurch die Immunisierung schneller verlaufen sollte. Auch sind Unterschiede in der Übertragungsrate von P. vivax und P. falciparum möglich. Unsere Typisierung von Stämmen über einen längeren Zeitraum ermöglicht, die „molekulare Infektionshäufigkeit“ zu bestimmen, also die Anzahl Infektionen pro Kind pro Jahr. Jedes Kind wurde im Schnitt mit über 14 P. vivax-Stämmen pro Jahr infiziert, aber nur mit etwa 6 P. falciparum-Stämmen. Die Infektionshäufigkeit änderte sich nicht mit dem Alter, dies lässt darauf schliessen, dass die Kinder mit der Zeit allmählich Immunität erlangten, und dadurch die Anzahl Erkrankungen zurückging. Dies schliesst natürlich nicht aus, dass auch Unterschiede in der Biologie eine Rolle spielt im Erlangen von Immunität.
Papua Neuguinea ist eines der Länder mit dem schlechtesten Gesundheitswesen und gleichzeitig einem hohen Auftreten von Malaria. Die Prävalenz von P. vivax ist manchen Gegenden gleich hoch wie diejenige von P. falciparum. Die hohe Multiplizität und Infektionshäufigkeit, wie auch der hohe Grad von genetischem Austausch zwischen Parasitenpopulationen, lässt auf einen hohen Widerstandsgrad gegenüber Massnahmen zur Malariakontrolle schliessen. Die schnelle Immunisierung gegen P. vivax führt dazu, dass es eine grosse Zahl von asymptomatischen Trägern gibt, die vermutlich immer noch zur Übertragung beitragen. Die Bekämpfung von P. vivax wird weiter erschwert durch die Leberstadien, welche noch Wochen oder Monate nach der Übertragung zu Krankheitsausbrüchen führen können. Der hohe Anteil von P. vivax an allen Malariafällen wird Papua Neuguinea vor grosse Herausforderungen stellen auf dem Weg zur Kontrolle und Elimination von Malaria.