Novel single-molecule force spectroscopy approaches to characterize interactions of membrane proteins

Abstract: Atomic force microscopy (AFM) based single-molecule force spectroscopy (SMFS) is a biophysical tool used to investigate folding and unfolding of biological macromolecules, like membrane proteins. Unfolding of single membrane proteins can be recorded by force-distance (FD) curves, which exhibit reproducible sawtooth-like patterns of force peaks. These force peaks reflect the unfolding of stable structural segments. In the case of α-helical transmembrane proteins, these segments consist of partial or complete α-helices, or even of several consecutive α-helices connected by extracellular or intracellular loops. Fitting these force peaks using polymer extension models reveals the exact position of the interaction within the membrane protein. Furthermore, with SMFS based dynamic force spectroscopy (DFS) it is possible to study intrinsic behavior of proteins, such as energetic, kinetic and mechanical properties, or, in other words, their energy landscape. The work presented here contains two SMFS-related projects that were carried out independently from each other. However, both projects are novel SMFS approaches that improve our understanding of α-helical transmembrane proteins.
In the first project, it was investigated how cholesterol, an essential component of eukaryotic membranes, and ligands modulate the energy landscape of the human β2 adrenergic G protein-coupled receptor (β2AR). G protein-coupled receptors (GPCRs) are a class of versatile proteins that transduce signals across membranes. Environmental changes induce inter- and intramolecular interactions that change the functional state of GPCRs and activate intracellular messenger molecules. How these interactions are established and how they modulate the functional state of β2AR was addressed in this project. Cholesterol considerably increased the kinetic, energetic, and mechanical stability of almost every structural segment at sufficient magnitude to alter the structure and function relationship of β2AR. One exception was the structural core segment of β2AR, which establishes multiple ligand-binding sites and which properties were not significantly influenced by cholesterol. This suggests that cholesterol may not necessarily influence ligand binding to β2AR rather than setting the GPCR into a different state so that the receptor will respond differently to ligand binding. For that purpose, SMFS and DFS approaches were used to investigate how ligand binding modulates the energy landscape of β2AR. Five different ligands that represented agonists, inverse agonists or neutral antagonists established a complex network of interactions that tuned the kinetic, energetic and mechanical properties of functionally important structural regions of β2AR. These interactions were specific to the efficacy profile of the investigated ligands, which suggests that the functional modulation of GPCRs follows structurally well-defined interaction patterns.
The second project addressed the problem that SMFS is a rather time-consuming technique, since the membranes embedding the membrane proteins must be imaged and localized before starting the actual SFMS measurement. In order to simplify the investigation of membrane proteins by SMFS the light-driven proton pump bacteriorhodopsin (BR) was reconstituted into lipid nanodiscs. The advantage of using nanodiscs is that membrane proteins can be handled and characterized like water-soluble proteins with similar ease. SMFS characterization of BR in native purple membranes and in nanodiscs revealed no significant alterations of structure, function, unfolding intermediates, and strengths of inter- and intra-molecular interactions. This demonstrates that lipid nanodiscs provide a unique approach for in vitro studies of native membrane proteins using SMFS and opens up a new avenue to characterize membrane proteins by a wide variety of SMFS approaches that have been established on water-soluble proteins. ---------- Zusammenfassung: Rasterkraftmikroskopie (AFM) basierte Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (SMFS) ist eine biophysikalische Anwendung, die es ermöglicht, Entfaltung und Faltung von biologischen Makromolekülen, zum Beispiel von Membranproteinen, zu studieren. Die Entfaltung von einzelnen Makromolekülen kann mittels einer Kraft-Abstands-Kurve gemessen werden. Eine typische Kraft-Abstands-Kurve, welche die Entfaltung eines Transmembranproteins widerspiegelt, weist eine sägezahnartige Struktur aus Peaks auf. Jeder dieser Peaks entspricht der Entfaltung eines stabilen strukturellen Segments des entfalteten Proteins. Bei α-helikalen Transmembranproteinen bestehen diese Segmente aus α-Helices (oder Teilen davon), oder sogar aus mehreren Transmembransegmenten, welche durch extra- oder intrazelluläre Loops miteinander verbunden sind. Die Peaks können mittels physikalischer Modelle, die das Verhalten steifer Polymere bei Dehnung beschreiben, gefittet werden. Dadurch kann die exakte Position, an welcher innerhalb des Membranproteins eine Interaktion auftritt, bestimmt werden. Des Weiteren ist es möglich, mit dynamischer Kraftspektroskopie (DFS), ein auf SMFS basierendes Verfahren, das intrinsische Verhalten von Proteinen zu untersuchen. Beispielsweise können mittels DFS biophysikalische Parameter, wie energetische, kinetische und mechanische Eigenschaften (Energielandschaft) von Proteinen bestimmt werden. Bei der im Folgenden vorgestellten Arbeit handelt es sich um zwei voneinander unabhängig durchgeführte SMFS-Projekte. Beide Projekte sind neuartige Ansätze, welche unser Verständnis von α-helikalen Transmembranproteinen verbessern.
Im ersten Projekt wurde der Einfluss von Cholesterin, einem essentiellen Bestandteil eukaryotischer Membranen, auf die Energielandschaft des humanen β2 adrenergen G-Protein-gekoppelten Rezeptors (β2AR) untersucht. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind die größte und vielseitigste Gruppe von Membranrezeptoren. Extrazelluläre Veränderungen induzieren inter- und intramolekulare Interaktionen, die den funktionellen Zustand von GPCRs modulieren und dadurch eine intrazelluläre Signalkaskade auslösen. In dem Projekt wurde untersucht, auf welche Art und Weise diese Interaktionen etabliert werden und wie sie den funktionellen Zustand des β2ARs beeinflussen. Cholesterin hatte einen wesentlichen Einfluss auf die Stärke der Interaktionen sowie die Energielandschaft fast aller struktureller Segmente des Rezeptors. Eine Ausnahme war das strukturelle Kernsegment von β2AR, welches eine Vielzahl von Ligandenbindungsstellen aufweist. Die Eigenschaften dieses Segmentes blieben auch in Gegenwart von Cholesterin unverändert. Da Cholesterin nicht notwendigerweise die Bindung von Liganden beeinflusst, ist zu vermuten, dass das Kernsegment seine Eigenschaften ändert, nachdem ein Ligand gebunden hat. Um diese Frage zu beantworten wurde mittels SMFS und DFS untersucht, wie die Bindung von Liganden an β2AR dessen Energielandschaft beeinflusst. Fünf Liganden unterschiedlicher therapeutischer Wirksamkeit etablierten ein Netzwerk von Interaktionen, welches die kinetischen, energetischen und mechanischen Parameter funktionell wichtiger struktureller Regionen des Rezeptors modulierte. Diese Interaktionen waren spezifisch entsprechend der Wirksamkeit des jeweiligen Liganden. Offenbar folgt die funktionelle Modulierung von GPCRs strukturell definierten Interaktionsmustern.
Bei SMFS von Membranprotein handelt es sich um relativ zeitintensive Messungen, da die Membranen, in die das zu untersuchende Protein eingebettet ist, zunächst abgebildet und lokalisiert werden müssen. Dieses Problem wurde im zweiten Projekt näher betrachtet. Um SMFS mit Membranproteinen zu vereinfachen, wurde die lichtgetriebene Protonenpumpe Bakteriorhodopsin in Nanodiscs rekonstituiert. Nanodiscs sind synthetische Modellmembranen, mittels derer Membranproteine ähnlich wie wasserlösliche Proteine behandelt werden können. Die Charakterisierung von nativem BR in der Purpurmembran sowie in Nanodiscs ergab keine signifikanten Unterschiede bezüglich Struktur, Funktion, Entfaltungsintermediaten sowie Stärke von inter- und intramolekularen Interaktionen. Diese Resultate bestätigen, dass Nanodiscs neue Möglichkeiten für SMFS-Studien an Membranproteinen in vitro bieten.