Elucidation of the activity, pharmacokinetics, and toxicity profiles of fasciocidal drug candidates 1,2,4-trioxolane OZ78 and 1,2,4,5-tetraoxane MT04

Abstract: Fascioliasis is a disease belonging to the most neglected tropical diseases. Causative agents are the food borne trematodes Fasciola hepatica and Fasciola gigantica, whereas F. hepatica is especially of human concern. F. hepatica and F. gigantica are setteled in the liver, bile ducts, and gallbladder and are therefore termed as liver flukes.
About 2.4 to 17 million people are infected worldwide with F. hepatica leading to a global burden of about 35’206 disability-adjusted life years (DALYs). Fascioliasis is a disease not only of human concern, but affects also farm animals, especially sheep and cattle.
Triclabendazole is the only known drug active against juvenile and adult F. hepatica infection. There are no alternative drugs available characterized by a similar activity and safety profile as triclabendazole. Resistance against triclabendazole has already been described in sheep and is spreading over the world. However, to date no resistance in humans has been detected. Nonetheless, screening for new drugs is urgent.
OZ78 was originally synthesized for malaria drug discovery and is a peroxidic compound. This synthetic peroxide has shown promising in vitro and in vivo activity against juvenile and adult F. hepatica. Moreover, OZ78 has shown to be active against a triclabendazole resistant F. hepatica strain (Oberon isolate).
In the framework of this PhD thesis preclinical investigations were carried out to further strengthen our knowledge on the potential of the synthetic compounds OZ78 and the related derivative MT04 for the treatment of F. hepatica infection. The aim was to find a lead candidate for further studies and to get a better understanding of the drug properties (pharmacokinetic / pharmacodynamic) of these substances.
Different promising trioxanes and tetraoxanes were tested in vitro and in vivo in more detail with regard to F. hepatica activity and results compared to OZ78 (1,2,4-trioxolane). MT04 (1,2,4,5-tetraoxane) was found to be even more active in vitro and in vivo (in rats) against adult and juvenile F. hepatica infection than OZ78. In contrast to OZ78, MT04 has two peroxide bridges. A dose of 50 mg/kg was enough to reach a complete worm burden reduction of 100% against adult F. hepatica in rats, and for juvenile treatment, a dose of 100 mg/kg was required.
In parallel, OZ78 has been tested in sheep according to activity, tolerability, and pharmacokinetic profiles. OZ78 failed to cure fascioliasis in sheep after an application of 50 mg/kg orally or subcutaneously - no reduction in faecal egg count or worm burden could be measured.
To elucidate pharmacokinetic parameters of OZ78 in sheep plasma, a liquid chromatography mass spectrometry (LC/MS) method was developed and validated in terms of accuracy, precision, stability, and selectivity. OZ78 and OZ352 (Internal standard, I.S.) had to be detected in negative mode, according to the mass of deprotonated parent compounds. Protein precipitation was used for sample clean up, recoveries of three concentrations of OZ78 (5, 1.25, and 0.3125 µg/ml) and I.S. (2 µg/ml) were 84.4%, 69.6%, 78.6% and 85.8%, respectively. Calibration line ranged from 5 µg/ml to 0.15625 µg/ml. The developed method demonstrated to be accurate, precise, and selective.
The pharmacokinetic profile of OZ78 following oral application was characterised by a maximal plasma concentration (Cmax) of 45.8±13 µg/ml after 1 h (Tmax). An estimated elimination half-life (t1/2) of 1.0±0.1 h and a mean area under the plasma time curve (AUC) of 116.2±47 µg h/ml were calculated for the oral administration. On the other hand, following subcutaneous treatment with OZ78, Cmax and Tmax were 13.7±6.1 µg/ml and 0.9±0.4 h, respectively. The α and β half-lives were 4.5±4.3 h and 56.5±36 h, respectively and the mean AUC was 219.1±74 µg h/ml.
Further studies were needed to determine the difference in therapeutic outcomes between rats and sheep. The LC/MS method for OZ78 in sheep plasma was adapted and validated for rat plasma measurements. In addition the OZ78 LC/MS method could be approximated, validated, and used for MT04 measurement in sheep and in rat plasma.
OZ78 and MT04 were applied at a dose of 50 mg/kg to rats, and after different time-points, samples were collected. Studies with MT04 according to efficacy and pharmacokinetics in sheep are outstanding, but are planned.
Following oral administration of 50 mg/kg in rats, the Cmax of MT04 and OZ78 were 49.8±9.1 and 70.1±19.1 µg/ml after 2.7±1.2 h and 1.6±1.6 h (Tmax), respectively. The AUCs were estimated at 31’258.8±6’232.7 and 29’794.1±3’990.6 µg min/ml for MT04 and OZ78, respectively. Mean elimination half-lives (t1/2) of MT04 and OZ78 were 6.4±5.7 h and 2.5±1.5 h, respectively.
Toxicity of OZ78 and MT04 was determined on a liver cell line (HepG2). Different viability and toxicity assays were done with OZ78 or MT04 combined with different iron containing solutions (haemin, Fe(II), and Fe(III)) to get a better understanding of the toxicity profiles of these substances. Reactive oxygen species (ROS) production of MT04 and OZ78 was measured in combination with these iron-solutions. OZ78 was only moderately toxic combined with iron, whereas the combination of MT04 with iron resulted in a significant toxicity. Additionally, a high ROS signal could be measured especially in combination with haemin for both substances.
In summary, OZ78 and MT04 are promising lead candidates for the development of anti-Fasciola drugs. OZ78 and MT04 were active against juvenile and adult infection in rats. The therapy failure in sheep after oral treatment can be explained by a too short exposure of the flukes to the drug. Another application has to be tested in sheep. To date, it is not clear if the applied doses are toxic and, more studies especially in animals are needed. However, ROS formation seems to be responsible for activity of these substances. ---------- Zusammenfassung: Fasziolose ist eine Erkrankung, die zu den vernachlässigten Tropenkrankheiten zählt. Verursacher sind die durch Ernährung übertragbaren Trematoden Fasciola hepatica und Fasciola gigantica, wobei F. hepatica besonders für Menschen Besorgnis erregend ist.
F. hepatica und F. gigantica leben in der Leber, Gallengängen und Gallenblase, und werden deshalb auch als Leberegel bezeichnet.
Etwa 2.4 bis 17 Millionen Menschen sind weltweit mit F. hepatica infiziert, was zu einer weltweiten Bürde von etwa 35'206 behinderungsbedingten Lebensjahren führt. Fasziolose ist nicht nur eine Erkrankung von Menschen, sondern auch landwirtschaftliche Nutztiere wie Schafe und Rinder sind betroffen.
Triclabendazol ist die einzige Substanz, die gegen juvenile und adulte F. hepatica Infektion wirkt. Es gibt keine alternativen Medikamente mit gleicher Aktivität und gleichem Sicherheitsprofil wie Triclabendazol. Resistenzen gegen Triclabendazol sind bereits in Schafen vorhanden und verbreiten sich über die Welt. Bis jetzt sind aber noch keine Resistenzen im Menschen beschriebe worden. Trotzdem ist es wichtig nach neuen Medikamenten zu suchen.
OZ78 wurde ursprünglich für die Malariabehandlung synthetisiert und gehört zu den Peroxiden. Dieses synthetische Peroxid hat versprechende Aktivitäten in vitro und in vivo gegen juvenile und adulte F. hepatica gezeigt. Überdies war OZ78 auch gegen einen Triclabendazol resistenten Stamm (Oberon Isolat) aktiv.
Im Rahmen meiner Dissertation, wurden präklinische Untersuchungen durchgeführt um das Wissen über die versprechenden Substanzen OZ78 und MT04 in der Behandlung von F. hepatica Infektion zu erweitern. Das Ziel war eine neue Leitsubstanz für weitere Studien zu finden und die Wirkweise der Substanzen besser zu verstehen (Pharmakokinetik / Pharmakodynamik).
In einer in vitro und in vivo Studie wurden verschiedene Trioxane und Tetraoxane auf ihre F. hepatica Aktivität im Detail getestet und mit OZ78 (1,2,4-Trioxolan) verglichen. Aus dieser Studie kam hervor, dass MT04 (1,2,4,5-Tetraoxan) noch aktiver in vitro und in vivo (in Ratten) gegen adulte und juvenile F. hepatica Infektionen war als OZ78. Im Unterschied zu OZ78, hat MT04 zwei Peroxid-Brücken. Eine Dosis von 50 mg/kg genügte um eine komplette Reduktion der Wurmbelastung von 100% gegen adulte F. hepatica in Ratten zu erreichen, für eine juvenile Behandlung war eine Dosis von 100 mg/kg nötig.
Parallel wurde OZ78 im Schaf getestet und Aktivität, Toleranz und Pharmakokinetik untersucht. Aber OZ78 schaffte es nicht Fasziolose im Schaf nach einer Anwendung von 50 mg/kg OZ78 oral oder subkutan zu heilen, keine Reduktion von Stuhleiern oder Würmern konnte gemessen werden.
Um die pharmakokinetischen Parameter von OZ78 im Plasma zu bestimmen, musste eine Flüssigchromatographische Massenspektrometrische (LC/MS) Methode entwickelt und auf Genauigkeit, Präzision, Stabilität, und Selektivität validiert werden. OZ78 und OZ352 (interner Standard, I.S.) musste im Negativ-Modus nach der Masse der deprotonierten Muttersubstanz detektiert werden. Eine Proteinfällung wurde zur Probenvorbereitung angewendet. Die Wiederfindungen von OZ78 (5, 1.25, und 0.3125 µg/ml) und von I.S. (2 µg/ml) waren 84.4%, 69.6%, 78.6%, und 85.8%. Kalibrationskurve reichte von 5 µg/ml zu 0.15625 µg/ml. Die entwickelte Methode war genau, präzis, und selektiv.
Das Pharmakokinetik-Profil von OZ78 nach oraler Injektion zeigte eine maximale Plasma Konzentration von (Cmax) 45.8±13 µg/ml nach 1 h (Tmax) auf. Die Halbwertszeit (t1/2) betrug 1.0±0.1 h und eine mittlere Fläche unter der Plasma Zeit Kurve (AUC) von 116.2±47 µg h/ml wurde für die orale Anwendung berechnet. Auf der anderen Seite, nach subkutaner Injektion mit OZ78, wurden ein Cmax und ein Tmax von 13.7±6.1 µg/ml und 0.9±0.4 h berechnet. Die α und β Halbwertszeit waren 4.5±4.3 h und 56.5±36 h, und die mittlere AUC war 219.1±74 µg h/ml.
Weitere Studien waren nötig um den Unterschied im Behandlungsergebnis zwischen Ratte und Schaf zu erklären. Die LC/MS Methode von OZ78 für Schafplasma wurde für Rattenplasma angepasst und validiert. Zusätzlich konnte die OZ78 LC/MS Methode modifiziert, validiert und für MT04 Messung in Schaf und Ratten Plasma verwendet werden.
OZ78 und MT04 wurden in einer Dosis von 50 mg/kg Ratten verabreicht und nach verschiedenen Zeitpunkten wurden Samples gezogen. Studien mit MT04 betreffend Aktivität und Pharmakokinetik im Schaf sind noch ausstehend, sind aber in Planung.
Nach oraler Applikation von 50 mg/kg in Ratten, wurden Cmax Werte von MT04 und OZ78 49.8±9.1 und 70.1±19.1 µg/ml nach 2.7 h±1.2 und 1.6±1.6 h (Tmax) gemessen. Die berechnete AUC ergab 31’258.8±6’232.7 und 29’794.1±3’990.6 µg min/ml für MT04 und OZ78. Mittlere Halbwertszeiten (t1/2) für MT04 und OZ78 waren 6.4 ±5.7 h und 2.5±1.5 h.
Zuletzt wurde die Toxizität von OZ78 und MT04 mit einer Leberzelllinie (HegG2) bestimmt. Verschiedene Toxizitäts- und Viabilitäts Assays wurden mit OZ78 oder MT04 kombiniert mit verschiedenen Einsenlösungen (Hämin, Fe(II) und Fe(III)) angewandt um das Toxizitätsprofil besser zu verstehen. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Produktion von MT04 und OZ78 wurden in Kombination mit diesen Eisenlösungen gemessen. OZ78 war nur mässig toxisch kombiniert mit Eisen, wobei eine signifikante Toxizität für MT04 in Kombination mit Eisen gefunden werden konnte. Ein hohes ROS Signal wurde für beide Substanzen vor allem in Kombination mit Haemin gemessen.
Zusammengefasst, OZ78 und MT04 sind vielversprechende „Lead“-Kandidaten in der Entwicklung eines Medikaments gegen Fasziola Infektionen. OZ78 und MT04 waren aktiv gegen juvenile und adulte Infektion in der Ratte. Das Therapieversagen in Schafen kann durch eine zu geringe Exposition der Saugwürmer im Schaf mit der Substanz erklärt werden. Eine andere Applikation im Schaf ist noch ausstehend. Bis jetzt lässt sich nicht sagen, wie toxisch die verwendeten Dosen sind, mehr Studien im Tier werden dafür benötigt. Die Aktivität der Substanzen scheint von der ROS Produktion abhängig zu sein.