Development and application of new approaches to study the epidemiology of "mycobacterium ulcerans" disease (Buruli ulcer) in Ghana

Mycobacterium ulcerans, causing the devastating skin disease Buruli ulcer (BU), has evolved from the fish pathogen M. marinum. By the acquisition of a virulence plasmid (pMUM) a progenitor of M. ulcerans has gained the unique property of producing a polyketide-derived macrolide toxin termed mycolactone. The toxin is responsible for the characteristic chronic ulcerative pathology of BU. Adoption of pMUM was probably the key event in the evolution of M. ulcerans, constituting a population bottleneck that led to the development of a new species with a highly clonal population structure. Subsequent reductive evolution is indicative for the adaptation to more stable environmental niches and led to the emergence of three M. ulcerans lineages considered as different ecotypes. M. ulcerans lineage 3, responsible for BU infections in Africa and Australia, is characterized by extremely low levels of genetic diversity. This genetic monomorphism has long hindered molecular epidemiological studies aiming at the identification of transmission pathways and environmental sources of M. ulcerans.
Our whole genome sequence comparison of Ghanaian M. ulcerans strains representing three previously identified variable number of tandem repeat (VNTR) types in Ghana, enabled the identification of single nucleotide polymorphisms (SNPs). Real-time PCR-based SNP typing assays at the detected SNP loci facilitated medium-throughput analyses of a comprehensive collection of Ghanaian M. ulcerans isolates. Typing results of M. ulcerans strains isolated between 1999 and 2007 from patients residing in the BU endemic Densu River Basin and another BU endemic area in the Amansie West district of Ghana demonstrated the presence of two different clonal complexes in the two regions. Local clustering of certain haplotypes within the Densu River Basin revealed that M. ulcerans is very focally transmitted, which excludes some of the currently discussed modes of transmission. Our recently developed temperature-switch PCR-based typing strategy is used by a reference laboratory in Ghana to monitor the spatio-temporal distribution and further spread of the detected M. ulcerans variants in that region.
M. ulcerans infection foci are commonly connected with close proximity to human-disturbed aquatic environments. While BU in Ghana is highly associated with residence along the lower part of the Densu River, where the construction of an impoundment has led to the formation of a lake and wetlands surrounding this area, no infections have so far been reported from villages located further upstream. However, results of our sero-epidemiology studies indicated that healthy inhabitants of communities both downstream (BU endemic) and upstream (BU non-endemic) of the Densu River are equally exposed to M. ulcerans. About one third of healthy individuals from both areas showed specific humoral responses against the M. ulcerans 18KDa small heat shock protein. Moreover, environmental samples collected in the BU endemic and non-endemic communities showed no significant difference in PCR positivity targeting M. ulcerans sequences.
Elusive transmission pathways and reservoirs of M. ulcerans combined with the lack of a vaccine against BU complicate the prevention of this disease. Since the current strategy to control BU relies on early case detection and rapid treatment, the identification of alternative drugs is of high importance. Therefore a compound screening platform for M. ulcerans was developed within the framework of this thesis and is currently used to screen compound libraries for new scaffolds which may eventually have the potential to replace rifampicin.
Taken together, the spatio-temporal patterns of M. ulcerans haplotypes in the Densu River Valley as well as the observed clustering of BU cases in certain communities along the Densu River indicate that the emergence of M. ulcerans infection foci cannot be solely explained by an interaction between M. ulcerans and the environment. We hypothesize that BU patients with ulcerative lesions containing vast loads of mycobacteria may play an active role in the dissemination of M. ulcerans in the environment. This would have major implications for strategies to better control the disease and remains to be investigated further. ---------- Zusammenfassung: Mycobacterium ulcerans, der Erreger der gravierenden Hauterkrankung Buruli-Ulkus (BU), hat sich aus dem Fischpathogen M. marinum entwickelt. Durch den Erwerb eines Virulenzplasmids (pMUM) hat ein M. ulcerans-Vorfahre die einzigartige Fähigkeit erlangt, ein Makrolid-Toxin namens Mycolakton zu produzieren, das für die BU-typische chronisch-ulzerative Pathologie verantwortlich ist. Die Aufnahme von pMUM war vermutlich das Schlüsselereignis für die Entstehung des Erregers und führte durch diesen genetischen „Flaschenhalseffekt“ zu der Entwicklung einer neuen Spezies mit hochklonaler Populationsstruktur. Die darauf folgende reduktive Evolution deutet auf die Anpassung an eine stabilere ökologische Nische hin und führte zu der Entwicklung von drei M. ulcerans Abstammungslinien, die verschiedene Ökotypen darstellen. Da die M. ulcerans Abstammungslinie 3, die BU Infektionen in Afrika und Australien hervorruft, nur minimale genetische Diversität aufweist, war die Erforschung der Herkunft und Übertragungswege von M. ulcerans durch Feintypisierung von Isolaten lange Zeit unmöglich.
Vergleiche der Genomsequenzen von Vertretern der drei in Ghana vorhandenen M. ulcerans VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) Varianten ermöglichte die Identifizierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen (single nucleotide polymorphisms, SNPs). Mit Hilfe der identifizierten SNP-Positionen wurden Real-Time PCR-basierende Assays entwickelt, mit denen M. ulcerans Isolate aus Ghana typisiert werden konnten. Die Typisierung von M. ulcerans Stämmen, die zwischen 1999 und 2007 von Patienten aus dem BU endemischen Densu Flussgebiet und einer anderen endemischen Region im Amansie West Bezirk isoliert wurden, hat gezeigt, dass in den beiden Regionen zwei unterschiedliche klonale M. ulcerans Komplexe vorherrschen. Da auch innerhalb des Densu Flussgebietes die Verbreitung der meisten M. ulcerans Varianten nur auf ein bestimmtes Teilgebiet begrenzt war, können einige der derzeit diskutierten Übertragungswege des offensichtlich sehr fokal übertragenen Erregers ausgeschlossen werden.
M. ulcerans Infektionsbrennpunkte sind im Allgemeinen mit aquatischen Umgebungen assoziiert, die durch den Menschen verändert worden sind. So tritt BU in Ghana vorwiegend entlang des unteren Densu Flussbereichs auf, in dem durch den Bau eines Staudamms ein See mit umliegenden Feuchtgebieten entstanden ist, während aus Dörfern im oberen Flussbereich noch keine Krankheitsfälle gemeldet wurden. Unsere sero-epidemiologischen Studien haben gezeigt, dass dennoch sowohl Bewohner aus Gemeinden flussabwärts (BU endemisch) als auch weiter flussaufwärts (nicht BU endemisch) gleichermassen mit M. ulcerans in Kontakt kommen. Bei etwa einem Drittel der gesunden Studienteilnehmer aus beiden Flussgebieten konnten spezifische Antikörper gegen das so genannte „18KDa small heat shock protein“ von M. ulcerans nachgewiesen werden.
Da Herkunft und Übertragungswege von M. ulcerans unklar sind und bis heute kein Impfstoff verfügbar ist, wird BU weniger durch Prävention, als vielmehr mit der Behandlung von Patienten in möglichst frühen Krankheitsstadien bekämpft. Daher ist die Suche nach alternativen Chemotherapeutika essentiell. Wir haben im Rahmen dieser Arbeit eine Screening-Plattform für M. ulcerans entwickelt, die nunmehr dazu verwendet wird, ausgewählte Wirkstoffbibliotheken auf neue Substanzen zu durchsuchen, die im besten Fall das Potential haben Rifampicin zu ersetzen.
Zusammengefasst, weisen sowohl die räumlich-zeitliche Verbreitung von M. ulcerans Varianten im Densu Flussgebiet als auch das fokale Auftreten von BU in bestimmten Gemeinden entlang des Flusses darauf hin, dass die Entstehung von M. ulcerans Infektionsbrennpunkten nicht nur auf eine Wechselwirkung zwischen M. ulcerans und der Umwelt zurückzuführen ist. Basierend auf unseren Beobachtungen vermuten wir, dass BU Patienten mit bakteriell hoch belasteten ulzerierenden Läsionen eine wichtige Rolle bei der Verbreitung des Erregers in der Umwelt spielen. Dies könnte bedeutende Konsequenzen für die Vorgehensweise bei der Bekämpfung von BU haben und liefert einen wichtigen Ausgangspunkt für zukünftige Forschung.