The TRF1 telomere protein is essential for the generation and maintenance of iPS cells and marks both pluripotent and adult stem cells

Abstract Englisch: Telomeres are nucleoprotein structures that protect the chromosomal ends from being recognized by DNA repair mechanisms as DNA double strand breaks. The Telomeric DNA is bound by various proteins that force the whole structure to fold in the so-called telomeric loop, hiding the DNA ends in the double stranded DNA. One of those sheltering proteins is the telomere repeat binding factor 1 (TRF1) which binds to the double-stranded telomeric DNA and is implicated in telomere length regulation. TRF1-deficient mice are embryonic lethal at the blastocyst stage and the conditional deletion of TRF1 in stratified epithelia leads to hair follicle stem cell defects, suggesting thus a role for TRF1 in stemness.
To address this and also the possibility of using TRF1 as an in vivo telomere length marker, here we generated a reporter mouse carrying a knock-in (KI) allele in which TRF1 is fused to the reporter protein eGFP. We find that eGFP-TRF1 expression is maximal at the adult stem cell compartments in the mouse, including the hair follicle stem cell niche and Lgr5-positive (Lgr5+) and Lgr5-low/negative stem cells at the intestinal crypts, and that eGFP-TRF1 expression is uncoupled from telomere length. Conditional deletion of TRF1 in the small intestine leads to a rapid collapse of the villi/crypt structures coincidental with increased DNA damage and apoptosis, indicating that TRF1 is essential to maintain small intestine homeostasis. Thus, TRF1 both marks adult stem cell compartments and is essential for their functionality. In line with this, we found very high levels of eGFP-TRF1 in induced pluripotent stem (iPS) cells, levels that are uncoupled from telomere elongation associated to reprogramming. TRF1 in iPS cells is expressed heterogeneous and coincident with the in-built heterogeneity of Nanog expression in iPS cell colonies. Selection of high eGFP-TRF1 iPS cells correlated with a higher pluripotency as indicated by their ability to form teratomas and chimeras. By using various loss-of-function approaches, we show that TRF1 is necessary for both the induction and the maintenance of pluripotency, by preventing the induction of DNA damage response and apoptosis. Finally, supporting the notion that TRF1 is a key factor for pluripotency we make the unprecedented finding that TRF1 is a direct target of the transcription factor Oct3/4, which binds to the TRF1 promoter and increases the transcription of TRF1, thus providing a mechanistic link between TRF1 and pluripotency.
These findings render TRF1 a novel marker for stem cells, those cells having the highest abundance of TRF1 in a given tissue. Also they deploy the eGFP-TRF1 mouse model as a useful tool for following up such stem cells in vivo and in vitro. ---------- Abstract Deutsch: Werden lose Chromosomenenden von DNS-Reparaturmechanismen erkannt führt dies zu Chromosomenfusionen, Zellseneszenz und Apoptose. Telomere, die Endstücke chromosomaler DNS sind Nukleoprotein-Strukturen mit der Aufgabe die Chromosomenenden davor zu schützen. Die telomerische DNS wird dabei von verschiedenen Proteinen erkannt, gebunden und zu einer Schleife geformt, deren Ende in der telomer-duplex DNA versteckt wird. Eines dieser Schutzproteine ist der „Telomere repeat binding factor 1“ (TRF1), welches die doppelsträngige Telomer-DNS bindet und bei der Regulation der Telomerlänge beteiligt ist. Wird TRF1 depletiert, sterben Embryonen bereits als Blastozysten, zeigen aber keine Telomeranomalitäten. Das konditionelle Ausschalten von TRF1 im mehrschichtigen Epithel (Keratin 5 exprimierendes Epithel) führt jedoch zu hoher Telomerfragilität und zum Verlust von Haarfollikeln was auf einen Stammzelldefekt hindeutet.
Um mögliche Stammzelleigenschaften sowie die Möglichkeit von TRF1 als in vivo Telomerlängenindikator zu eruieren, wurde hier eine knock-in Maus generiert, bei der eine eGFP-Kassette in das Aminoende des TRF1-Lokus fusioniert wurde. Mit diesem Model konnte ich zeigen, dass die eGFP-TRF1-Expression in den adulten Stammzellnischen der Haarfollikel und der Dünndarm-Krypten erhöht ist. Konditionelles ausknocken von TRF1 im Dünndarm führte zu einem schnellen Kollaps der Villi/Krypt-Struktur sobald TRF1 in allen Stammzellen eliminiert war. Übereinstimmend mit den erhöhten TRF1-Levels in adulten Stammzellen, zeigten auch induzierte, pluripotente Stammzellen (iPSz) eine deutlich erhöhte Expression von eGFP-TRF1, was aufgrund aktiver Telomerase und sich verlängernder Telomere erwartet werden konnte. Überraschenderweise ist die Menge an TRF1 während des Reprogramierungsprozesses überproportional zur Telomerlänge angestiegen; auch in Zellen die keine Fähigkeit hatten die Telomere zu verlängern. Die Expression von eGFP-TRF1 in iPS-Zellkolonien ist heterogen und korreliert mit Nanog, einem Stammzellmarker der in iPS-Zellen ebenfalls variiert und die Pluripotenz der Zellen positiv beeinflusst. IPS-Zellen mit hoher eGFP-TRF1 Expression waren potenter, subkutane Teratome zu bilden und beteiligten sich an der Formation von Chimären. Mit verschiedenen TRF1 knock-out und knock-down Studien konnte ich belegen, dass TRF1 für die Induktion, wie auch für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz essentiell ist. Ebenfalls bewiesen wir, dass OCT3/4, ein Transkriptionsfaktor für Pluripotenzgene, an die TRF1 Promoter-Region bindet und die TRF1 Transkription positiv beeinflusst.
Diese Resultate zeigen TRF1 als einen wesentlichen Faktor der für Pluripotenz und einem neuen Marker für Stammzellen in vitro und in vivo. EGFP-TRF1 konnte aber nicht als in vivo Telomerlängenindikator etabliert werden. ---------- Abstract Espanol: Los telómeros son estructuras nucleoproteicas que evitan que los extremos de los cromosomas sean reconocidos por los mecanismos de reparación del ADN como roturas en la doble hebra de ADN. El ADN telomérico está unido a varias proteínas que facilitan la formación del denominado bucle telomérico, y que protege los extremos del ADN bicatenario. La proteína TRF1 (telomere repeat binding factor 1) es un miembro del complejo proteíco especializado de protección telomérica que se une al ADN cadena doble y está implicada en la regulación de la longitud telomérica. Los ratones deficientes en TRF1 adolecen de letalidad embrionaria en la etapa de blastocito y la deleción condicional de esta proteína en el epitelio estratificado conduce a defectos en las células madre del folículo piloso, lo que sugiere por tanto una implicación funcional de TRF1 en pluripotencia.
Con el fin de elucidar esta conexión entre TRF1 y pluripotencia y también el posible empleo de TRF1 como un marcador de longitud telomérica in vivo, generamos un ratón “reporter” que contiene un alelo knock-in (KI) en el que TRF1 está fusionada a la proteína eGFP. La expresión de eGFP-TRF1 alcanza, de manera independiente de la longitud telomérica, valores máximos en los compartimentos de células madre adultas, entre los que se incluyen el nicho de células madre del folículo piloso y las células madre Lgr5-positivas (Lgr5+) y Lgr5-negativas (Lgr5-) de las criptas intestinales. La deleción condicional de TRF1 en el intestino delgado desencadena un rápido colapso de las vellosidades y criptas intestinales, coincidente con un aumento en el daño en el ADN y en la apoptosis, lo cual indica que TRF1 es esencial en el mantenimiento de la homeostasis del intestino delgado. Por consiguiente, TRF1 demarca los compartimentos de células madre adultas y es indispensable para su funcionalidad. En consonancia con lo anterior, describimos la presencia de niveles muy elevados de eGFP-TRF1 en las células madre pluripotentes inducidas (células iPS), valores que son independientes del alargamiento telomérico asociado a la reprogramación nuclear. Además, los niveles de TRF1 entre las diferentes células de las colonias de Ips son heterogéneos y coincidentes con la también intrínsecamente heterogénea expresión de Nanog. En las células iPS los altos niveles de eGFP-TRF1 correlacionan con una mayor pluripotencia, asociada a una mayor capacidad para formar teratomas y quimeras. Por medio de diferentes ensayos de pérdida de función, demostramos que TRF1 es necesaria para la inducción y mantenimiento de la pluripotencia, evitando que se desencadene la respuesta de daño en el ADN y la apoptosis. Por último, la idea de que TRF1 sea un factor clave se ve respaldada por el hallazgo sin precedentes de que TRF1 es una diana directa del factor de transcripción Oct3/4, cuya unión al promotor de TRF1 activa la transcripción de TRF1, lo que proporciona un mecanismo que conecta la proteína telomérica TRF1 con la pluripotencia.
Estos resultados convierten a TRF1 en un nuevo marcador de células madre, debido a que su expresión es máxima en las células madre de un tejido dado y al modelo de ratón eGFP-TRF1 en una útil herramienta para el seguimiento de estas células madre in vivo e in vitro.