Synthese eines Deazaflavin-überbrückten Fe(III)-Porphyrins zur Untersuchung der photophysikalischen Wechselwirkungen eines Deazaflavinyl-Inhibitors mit dem Cofaktor von Cytochrom P450 3A4

Tatsächlich ist die Fluoreszenz des Deazaflavins gelöscht, solange der Inhibitor im aktiven Zentrum gebunden ist. Wird er durch stärker bindende Substrate oder Inhibitoren (z.B. Ketoconazol) aus dem aktiven Zentrum in das umgebende Milieu verdrängt, so kehrt die Fluoreszenz zurück. Stärker inhibierende Substanzen können somit durch das Auftreten von Fluoreszenz leicht anhand einfacher Fluoreszenz-detektion nachgewiesen und bereits im Vorfeld verworfen werden. Dies könnte aufwendige Inihibtionsstudien erheblich verkürzen, welche bei der Entwicklung neuer Pharmaka unerlässlich sind, da bis zu drei Substrate oder Inhibitoren gleichzeitig im aktiven Zentrum binden können (drug drug interactions).
In Schema 2 ist die 8-stufige Synthese des Inhibitors abgebildet, ausgehend von kommerziell erhältlichem Testosteron (1) und 6-Chlorouracil (5). Die in vitro Inhibitionsstudien mit 6β-Deazatesto (11) und rekombinantem CYP3A4 wurden mit den drei Hauptsubstraten Testosteron, Midazolam, Nifedipin sowie dem fluoreszenten 7-Benzyloxy-4-trifluorocoumarin (BFC) durchgeführt. Schema 3 zeigt die Struktur der Substrate und die jeweiligen IC50-Werte. Bei den ersten drei Substraten wurde der Anteil an Metabolit zur Bestimmung des IC50 herkömmlich durch chromatographische Trennung mit nachfolgender UV-Detektion bestimmt. Für BFC, dessen Metabolit HFC starke Fluoreszenz aufweist, konnte der IC50 anhand von Fluoreszenzdifferenzspektren bestimmt werden. Bemerkenswert ist die Tatsache, dass alle IC50 in einem schmalen Bereich von 0.5 bis 5 μM liegen. Dies deutet darauf hin, das der Metabolismus aller Substrate in gleicher Weise inhibiert wird. CYP3A4 verfügt über ein voluminöses aktives Zentrum, sodass bis zu drei Substrate, Effektoren oder Inhibitoren gleichzeitig binden können. Als Folge tritt vermehrt homo- und heterotrope Kooperativität auf. Der Metabolismus von Testosteron wird durch Nifedipin (IC50=50 μM) stark inhibiert, wohingegen umgekehrt der Metabolismus von Nifedipin durch Testosteron nur unmerklich beeinflusst wird. Eine ähnliche heterotrope Kooperativität tritt auch bei Testosteron und Midazolam auf, welche ebenfalls gleichzeitig in der active site binden können. Demzufolge liegen die IC50 oftmals weit auseinander. Aufgrund der grossen Bandbreite an Substraten und der drei Substratbindungsstellen, treten eine Fülle von drug drug interactions auf, welche mit Hilfe aufwendiger Inhibitionsstudien bestimmt werden müssen. Die Ergebnisse in Schema 3 zeigen auf, dass sich 6β-Deazatesto als Referenzsubstanz zur Bestimmung der Inhibitorqualitäten potentieller Pharmaka eignet. Ein weiterer positiver Effekt beruht in der Tatsache, dass alle IC50 in dem industriell signifikanten Bereich von 1-10 μM liegen. Stärker bindende Pharmaka, welche über eine deutlich grössere Affinität gegenüber CYP3A4 verfügen, könnten zu toxischen Plasmaspiegeln anderer Pharmaka führen. Diese können bereits in einfachen Vorversuchen verworfen werden, wenn eine Fluoreszenz innerhalb des Assays beobachtet wird. Teure und aufwendige Inhibitionsstudien sowie zeitlich anspruchsvolle chromatographische Trennungen können somit durch ein rasches visuelles Screening ersetzt werden.
Um den Mechanismus der Fluoreszenzlöschung besser verstehen zu können, wurde ein geeignetes Modellsystem (Totalsynthese über 26 Stufen) zur detaillierten spektroskopischen Untersuchung der Enzym-Inhibitor-Wechselwirkung innerhalb der active site des Enzyms entwickelt. Hierfür wurden folgende zwei Modellverbindungen zur Simulation der Deazaflavin-Häm-Wechselwirkung als geeignet angesehen. Bei den Modellverbindungen (Schema 4) ist ein Deazaflavin über die distale Seite eines Porphyrins (24) bzw. Fe(III)-Porphyrins (25) verbrückt und simuliert hiermit die Wechselwirkung von Deazaflavin mit einem Fe(III)-Porphyrin. Damit das Deazaflavin über das Porphyrine verbrückt werden konnte, wurden zwei Spacer an Position 3 und 8 eingeführt. Für die Herstellung des 8-alkylierten Deazaflavins wurde eine neue Synthesemethode entwickelt (Schema 5). Die spätere Kopplung der Deazaflavindi-carbonsäure mit dem Bisaminoporphyrin, gelang mittels Überführung in den Bispentafluorophenyl-Aktivester. Die Synthese des Bisaminoporphyrins erfolgte über 13 Stufen nach der Standardprozedur. Als proximaler Ligand diente ein aromatisches Thiolat in Anlehnung an natives P450, bei welchem der proximale Ligand aus einem Cysteinat besteht. Der Abstand der beiden Chromophore wurde zu 4.0-4.3 Å ermittelt. Die Kopplung von Deazaflavin und Porphyrin (Schema 6) verlief trotz zahlreicher Kopplungsreagenzien und diverser Reaktionsbedingungen nur mit moderater Ausbeute. Die Kopplung sowie die nachfolgende Eiseninsertion wurde stets unter Ausschluss von Sauerstoff bewerkstelligt, da das freie Thiol und das Fe(III)-Thiolat sehr oxidationsempfindlich sind.
Die Modellverbindungen 24 und 25 zeigten keinerlei Deazaflavin-Fluoreszenz und bestätigen somit das beobachtete Fehlen der Fluoreszenz von 6β-Deazatesto in Anwesenheit von Häm b. 25 verfügte weder über Porphyrin-, noch über Deazaflavin-fluoreszenz. Aus diesem Grund wurde zunächst die weniger komplexe Verbindung 24 spektroskopisch untersucht. Mit Hilfe von steady-state und zeitaufgelösten Fluoreszenz- sowie UV-Vis-Differenz-spektren (pumpe-probe Technik) und Bestimmung der Oxidations- und Reduktions-potentiale (ZV/DPV) konnte für beide Verbindungen ein Energieniveau-Diagramm zur detaillierten thermodynamische Analyse berechnet werden. Das Deazaflavin-Singulett P-1D* in 24 (Schema 7, links) kann entweder durch Resonanzenergietransfer (RET) hin zum Porphyrin-Singulett 1P*-D (i) oder Elektro-2.83
87
82
0
hυ kf
P = Porphyrin ( 24 )
D = 5-Deazaflavin ( 24 )
Blau = Exp. Geschw. konstanten
Lila = berechnete Geschw. konstante des
Elektronen-Rücktransfer
Thermodynamisch ungünstig /
Nicht beobachtet
2*1013 s-1 4*108 s-1
3.3*1012 s-1
2.5*109 s-1
k-CS = 9*1011 s-1
i)
ii)
E0
Red(1D*) = +1.85 V
E0
Ox(P) = +0.73 V
1.1.
Max10 %-. S1
S0
S1
3PFe
*-D
T1
PFe-3D*
T1
kF,D kCR
kCS2
kSEET
kP kF,P
ΔG ( eV )
2.83
1.89
0
Lila: Literaturwerte
SEET = Singulett-Singulett-RET
TEET = Triplett-Triplett-RET
1.50
1.79
Nicht beobachtet / Thermodynamisch
ungünstig
kTEET
2.46
kISC
kCS
PFe = Porphyrin ( 25 )
D = 5-DEazaflavin (25 )
kISC = 2.9*1012 s-1kCS =9.6*1010 s-1
nentransfer hin zum charge transfer Komplex 1P+.-1D-. (ii) deaktiviert werden. Aufgrund der geringen Energiedifferenz zwischen 1P*-D und 1P+.-1D-. wird von einem raschen vorgelagerten Gleichgewicht ausgegangen und eine klare Trennung der beiden Reaktionspfade ist hiermit erschwert. Aufgrund des stark positiven Reduktionspotentiales von 1D* wird davon ausgegangen, dass dessen Deaktivierung überwiegend über einen direkten Elektronentransfer erfolgt. Die Bildung des charge transfer Komplexes 1P-.-1D+. war aufgrund der ermittelten Redoxpotentiale thermodynamisch stark endergon und wurde nicht weiter berücksichtigt. Obwohl sich die Verbindungen 24 und 25 lediglich durch ein Eisenatom unter-scheiden, verfügen beiden über eine stark differente Photophysik. Das Eisen(III)-Ion innerhalb des Porphyrinmakrozyklus verfügt im high spin Zustand über fünf ungepaarte Elektronen. Im angeregten Zustand 1PFe*-D weist Porphyrin ebenfalls ein ungepaartes Elektron auf, welches mit den ungepaarten Elektronen des Eisens wechselwirkt. Dies führt zu einer Aufspaltung der Singulett und Triplettzustände und ermöglicht und beschleunigt das inter system crossing (ISC). Das Fehlen der Porphyrinfluoreszenz rührt folglich nicht von dem Schweratomeffekt her. Das Deazaflavin-Singulett PFe-1D* verfügt ebenfalls über ein ungepaartes Elektron, welches über die Distanz von 4.0-4.3 Å mit den ungepaarten Eisenelektronen wechselwirkt. Die Präsenz des Eisens führt somit zu beschleunigtem ISC des Deazaflavin- und Porphyrin-Singuletts und somit zur Fluoreszenzlöschung.