Discovery of antiprotozoal compounds from medicinal plants

Tropical parasitic diseases such as malaria, human African trypanosomiasis, chagas disease, and leishmaniasis affect hundreds of millions of people worldwide and have devastating consequences. Current drugs available to treat these diseases have serious drawbacks. New drugs are urgently needed.
Natural products (NPs) play a dominant role in drug discovery for the treatment of human diseases. Particularly, quinine and artemisinin have their origin in nature and have inspired successful drugs for malaria treatment.
In a medium throughput screening, a total of 507 extracts from South African plants were assayed for their antiprotozoal activity against Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei rhodesiense, Trypanosoma cruzi and Leishmania donovani. Extracts from Abrus precatorius L. ssp. africanus Verdc. (Fabaceae) and Drypetes gerrardii Hutch. var. gerrardii (Putranjivaceae) inhibited at least one of the parasites at a test concentration considered relevant. With the aim of identifying the compounds responsible for these activities, a HPLC-based activity profiling approach followed by dereplication was applied. Targeted isolation of promising compounds was achieved by a combination of chromatography techniques. Structure elucidation was achieved by HR-ESI-MS and NMR (1H, 13C, COSY, HMBC, HSQC, and NOESY spectroscopy). Absolute configuration was determined by comparison of electronic circular dichroism (ECD) spectra with calculated ECD data.
HPLC-based activity profiling of A. precatorius allowed the identification of abruquinones, as responsible for the trypanocidal activity of the crude extract. A total of ten abruquinones were isolated. Among these were five new compounds. Abruquinone B, I, A, D, K, and L showed remarkable inhibition (0.16 ± 0.060, 0.28 ± 0.051, 0.02 ± 0.003, 0.01 ± 0.001, 0.11 ± 0.053, and 0.02 ± 0.053, respectively) and notable selectivity, expressed as selectivity indices (SIs) which were calculated from cytotoxicity data in L-6 cells (51, 74, 1379, 668, 508, and 374, respectively). These results warrant in vivo assessment of abruquinones.
Abruquinones are promising hits due to their strong and selective in vitro inhibition of T. b. rhodesiense, their good compliance with Lipinski’s “rule-of-5” and other molecular properties, as well as their predicted low/moderate toxic potential.
Two different extracts of D. gerrardii showed antiprotozoal activity, and the active constituents were tracked and isolated by HPLC-based activity profiling. The CH2Cl2/MeOH (1:1) stems extract inhibited L. donovani and P. falciparum. The major compound, a new phenanthrenone, showed good in vitro activity (IC50 of 0.9 ? 0.3 mM) and selectivity (SI of 68) against P. falciparum. Based on these promising results, in-vivo studies were conducted. However, the compound was not able to reduce parasitemia in the P. berghei mouse model. A phenanthrenone heterodimer was also isolated and showed in vitro antiplasmodial activity (IC50 of 2.04 ? 0.15 mM and SI of 31). Furthermore, the CH2Cl2/MeOH (1:1) leaves extract displayed trypanocidal properties, and the known saponin putranoside A was isolated and tested against T. b. rhodesiense, (IC50 of 18.0 ? 3.8 mM and a SI of 4).
The phenanthrenone was the most active and selective in vitro inhibitor of P. falciparum, but showed no inhibition in vivo against P. berghei. However, the compound fulfilled Lipinski’s “rule-of-5” and other molecular properties, which indicates a potential to meet requirements of an ideal antimalarial drug such as, oral bioavailability and blood-brain barrier permeability. According to Medicines for Malaria Venture compound progressing criteria, the phenanthrenone complies with some of the features of a validated hit such as sufficient activity against P. falciparum in vitro (? 1 ?M).
Additionally, as part of a project aimed at investigating antiprotozoal European plants Chrysanthemum cynerariifolium (Trevir.) Vis. (Asteraceae), Laurus nobilis L. (Lauraceae), and Eupatorium cannabinum L. (Asteraceae) were studied. A hexane extract of C. cynerariifolium showed promising activity against P. falciparum. Pyrethrins (irregular monoterpenes) were the metabolites responsible for the antiplasmodial activities. Particularly, pyrethrin II and jasmolin II inhibited P. falciparum (IC50 4.0 ? 1.1 ?M and 5.0 ? 0.4 ?M, respectively and SI of 24 and 6, respectively) in vitro. Synthetic pyrethroids were also tested, but they did not show activity.
Finally, as a contribution to the structure activity relationship study of sesquiterpene lactones showing activity against T. b. rhodesiense, costunolide and zaluzanin D were isolated from Laurus nobilis L. (Lauraceae) and eupatoriopicrin from Eupatorium cannabinum L. (Asteraceae). Germacrolides, i.e. costunolide and eupatoriopicrin, showed a higher inhibition (IC50 of 1.3 ? 0.4 mM and 1.2 ± 0.2 mM, respectively) on the protozoon, than the guaianolide zaluzanin D (IC50 of 10.8 mM).
In brief, a total of 22 secondary metabolites were isolated from five species. Among them, seven new compounds were discovered. These compounds belong to the structural classes of isoflavonoids, phenanthrenones, and terpenes such as, sesquiterpene lactones, irregular monoterpenes and triterpenoid saponins. Most of them (15 compounds) exhibited in vitro antiprotozoal activity. The most promising compounds were the abruquinones and the phenanthrenone, which strongly and selectively inhibited T. b. rhodesiense and P. falciparum, respectively. Abruquinones and the phenanthrenone are drug-like compounds with a calculated toxic potential ranging from low to moderate.
ZUSAMMENFASSUNG
Tropische parasitäre Krankheiten wie Malaria, afrikanische Trypanosomiasis (Schlafkrankheit), Chagas-Krankheit und Leishmaniose betreffen Hunderte von Millionen Menschen weltweit und haben verheerenden Folgen. Aktuelle Medikamente, die zur Behandlung dieser Krankheiten zur Verfügung stehen, haben gravierende Nachteile. Neue Medikamente werden dringend benötigt.
Naturstoffe (NP) spielen eine dominierende Rolle in der Wirkstoffforschung für die Behandlung von menschlichen Erkrankungen. So haben Chinin und Artemisin ihren Ursprung in der Natur und führten zu erfolgreichen Medikamenten zur Malariabehandlung.
In einem mittleren Durchsatz-Screening wurden insgesamt 507 Extrakte von südafrikanischen Pflanzen auf ihre Aktivität gegen Protozoen - Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei rhodesiense, Trypanosoma cruzi und Leishmania donovani - getestet. Extrakte von Abrus precatorius L. ssp. africanus Verdc. (Fabaceae) und Drypetes gerrardii Hutch. var. gerrardii (Putranjivaceae) haben mindestens einen der Parasiten in einer als relevant bezeichneten Testkonzentration gehemmt.
Mit dem Ziel die für diese Aktivitäten verantwortlichen Verbindungen zu identifizieren wurde ein Ansatz bestehend aus HPLC-basiertes Aktivitäts-Profiling gefolgt von Dereplikation verwendet. Gezielte Isolierung der vielversprechenden Verbindungen erfolgte durch eine Kombination von Chromatographie-Techniken. Die Strukturaufklärung wurde durch HR-ESI-MS und NMR (1H, 13C, COSY, HMBC, HSQC, und NOESY Spektroskopie) durchgeführt. Die absolute Konfiguration wurde durch den Vergleich der elektronischen Zirkulardichroismus-(ECD)-Spektren mit berechneten ECD-Daten bestimmt.
HPLC-basiertes Aktivitäts-Profiling von A. precatorius ermöglichte die Identifizierung von Abruquinonen, als verantwortliche Substanzen für die trypanozide Aktivität des Rohextrakts. Es wurden insgesamt 10 Abruquinone isoliert, darunter fünf neue Verbindungen. Abruquinone B, I, A, D, K und L zeigten bemerkenswerte Hemmung (0.16 ± 0.060, 0.28 ± 0.051, 0.02 ± 0.003, 0.01 ± 0.001, 0.11 ± 0.053, und 0.02 ± 0.053) und beachtenswerte Selektivität, wiedergegeben als Selektivitätsindizes (SIs) die aus der Zytotoxizität in L-6 Zellen (51, 74, 1379, 668, 508, und 374) ermittelt wurden.
Wegen ihrer starken und selektiven in vitro Hemmung von T. b. rhodesiense, ihrer guten Übereinstimmung mit Lipinski’s „5er Regel“ und anderen molekularen Eigenschaften, sowie ihrem niederen/mässigen toxischen Potenzial sind Abruquinone vielversprechende Hits. Deshalb sind weitere Studien notwendig um botanische oder chemische Quellen sicherzustellen und die in-vivo Wirksamkeit dieser Verbindungen zu bestimmen.
Zwei verschiedene Extrakte von D. gerrardii zeigten Aktivität gegen Protozoen. Die aktiven Bestandteile wurden mit Hilfe vom HPLC-basiertem Aktivitäts-Profiling identifiziert und isoliert. Der CH2Cl2/MeOH (1:1) Extrakt aus den Stängeln hemmte L. donovani und P. falciparum. Die Hauptverbindung, ein neues Phenanthrenon, zeigte gute in vitro Aktivität (IC50 von 0.9 ? 0.3 mM) und Selektivität (SI von 68) gegen P. falciparum. Basierend auf diesen vielversprechenden Resultaten wurden in vivo Studien durchgeführt. Allerdings war diese Verbindung nicht in der Lage die Parasitenbelastung im P. berghei Mausmodell zu reduzieren. Es wurde ebenfalls ein Phenanthrenon-Heterodimer isoliert, der in vitro Aktivität gegen Plasmodien (IC50 von 2.04 ? 0.15 mM und SI von 31) aufwies. Ausserdem zeigte der CH2Cl2/MeOH (1:1) Blattextrakt ausgewiesene trypanozidale Eigenschaften. Aus diesem Extrakt wurde das bekannte Saponin Putranoside A isoliert und gegen T. b. rhodesiense, (IC50 von 18.0 ? 3.8 mM und SI von 4) getestet.
Das Phenanthrenon war der aktivste und selektivste in vitro Inhibitor von P. falciparum, zeigte jedoch keine Hemmung in vivo gegen P. berghei. Die Verbindung erfüllte jedoch Lipinski’s „5er Regel“ und andere molekulare Eigenschaften, wie orale Bioverfügbarkeit und Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke, was ein mögliches Potenzial aufzeigt den Anforderungen eines idealen Antimalariawirkstoffs gerecht zu werden. Nach „Medicines for Malaria Venture“-Kriterien für die weitere Entwicklung eines Wirkstoffs erfüllt das Phenanthrenon einige der Merkmale eines validierten Hits wie ausreichende in vitro Aktivität gegen P. falciparum (? 1 ?M).
Als weiterer Teil des Projekts wurde die Wirkung von europäischen Heilpflanzen Chrysanthemum cynerariifolium (Trevir.) Vis. (Asteraceae), Laurus nobilis L. (Lauraceae), und Eupatorium cannabinum L. (Asteraceae) gegen Protozoen studiert. Ein Hexan-Extrakt von C. cynerariifolium zeigte vielversprechende Aktivität gegen P. falciparum. Phyrethrine (unregelmässige Monoterpene) waren die Inhaltsstoffe verantwortlich für die antiplasmodiale Aktivität. Besonders Pyrethrin II und Jasmolin II hemmten P. falciparum (IC50 4.0 ? 1.1 ?M und 5.0 ? 0.4 ?M, und SI von 24 und 6) in vitro. Es wurden auch synthetische Pyrethroide getestet, sie zeigten aber keine Aktivität.
Schliesslich, als Beitrag zu den Struktur-Aktivitätsuntersuchungen von Sesquiterpenlactonen mit Aktivität gegen T. b. rhodesiense, wurden Costunolid und Zaluzanin D aus Laurus nobilis L. (Lauraceae) und Eupatoriopicrin aus Eupatorium cannabinum L. (Asteraceae) isoliert. Germacrolides, d.h. Costunolid und Eupatoriopicrin, zeigten eine höhere Hemmung (IC50 von 1.3 ? 0.4 mM und 1.2 ± 0.2 mM) auf Protozoen als das Guaianolid Zaluzanin D (IC50 von 10.8 mM).
Es wurden insgesamt 22 Sekundärmetaboliten aus fünf Arten isoliert, darunter sieben neue Verbindungen. Diese Substanzen gehören zu den Strukturklassen der Isoflavonoide, Phenanthrenone und Terpene einschliesslich Sesquiterpenelactone, unregelmässige Monoterpene und Triterpenoidsaponine. Die meisten von ihnen (15 Verbindungen) zeigten in vitro Aktivität gegen Protozoen. Die vielversprechendsten Verbindungen waren die Abruquinone und das Phenanthrenon, die starke und selektive Hemmung gegen T. b. rhodesiense und P. falciparum zeigten. Abruquinone und das Phenanthrenon sind drug-like Verbindungen mit einem rechnerischen toxischen Potential von gering bis mässig.